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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

[交流] 关于转化 已有2人参与

最近做转化，第一次和第二次由于载体的问题，没有成功，在换了载体之后，蓝白斑筛选平板上居然全是白色的菌落，而且pcr鉴定后居然连接成功，真的是很诡异的事情啊，就算连接效率高，也不能全部是白斑吧，各位大神有没有相同经历啊
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
1楼 2012-10-31 22:07:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-02 13:47:16
当使用双酶切做连接时，如果酶切比较完全，而且连接体系载体：目的片段比例合适，阳性克隆可能接近100%。所以我只有在自连概率大的时候才做蓝白斑筛选。
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2楼2012-11-01 06:59:27
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-01 06:59:27
当使用双酶切做连接时，如果酶切比较完全，而且连接体系载体：目的片段比例合适，阳性克隆可能接近100%。所以我只有在自连概率大的时候才做蓝白斑筛选。

问题是只是单酶切啊，纠结
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
3楼2012-11-01 10:55:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-02 13:47:27
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3楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-11-01 10:55:08
问题是只是单酶切啊，纠结...

你是否把载体做了去磷酸化处理？如果这样载体不能自连，必需和插入片段连。要么就是你的目的片段也有抗性筛选基因，也可能使筛选板上基本是阳性克隆。当然，如果你的x-gal失效了的话另当别论。
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4楼2012-11-01 14:04:42
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
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4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-01 14:04:42
你是否把载体做了去磷酸化处理？如果这样载体不能自连，必需和插入片段连。要么就是你的目的片段也有抗性筛选基因，也可能使筛选板上基本是阳性克隆。当然，如果你的x-gal失效了的话另当别论。...

额，之前做的时候也怀疑是x-gal失效了，后来换了载体就全是白斑了，pcr也有产物，就是条件老摸索不对，都做过梯度了，还是非特异性太严重
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
5楼2012-11-01 17:10:22
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cicelyzh

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5楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-11-01 17:10:22
额，之前做的时候也怀疑是x-gal失效了，后来换了载体就全是白斑了，pcr也有产物，就是条件老摸索不对，都做过梯度了，还是非特异性太严重...

你是指什么条件不对，非特异性严重又指什么呢？是说菌落PCR吗？
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6楼2012-11-02 06:59:32
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竹子小小

木虫 (小有名气)
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都连接成功了还有什么好纠结的呢，不成功还白班才应该纠结的吧
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7楼2012-11-02 10:30:20
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 06:59:32
你是指什么条件不对，非特异性严重又指什么呢？是说菌落PCR吗？...

就是pcr摸索不对条件啊，非特异性的条带很多，今天一个同学做那个pcr，居然什么都没有，难道我上次做的是幻觉？、？
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
8楼2012-11-02 20:20:42
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)
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7楼: Originally posted by 竹子小小 at 2012-11-02 10:30:20
都连接成功了还有什么好纠结的呢，不成功还白班才应该纠结的吧

纠结为什么不是一般的状况呢
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
9楼2012-11-02 20:21:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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8楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-11-02 20:20:42
就是pcr摸索不对条件啊，非特异性的条带很多，今天一个同学做那个pcr，居然什么都没有，难道我上次做的是幻觉？、？...

筛阳性克隆的菌落PCR为什么直接用载体的引物？虽然用基因特异引物更好，但你既然把握不好条件，用载体多克隆位点两边的引物更加简单易行。
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10楼2012-11-03 07:30:35
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