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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

[交流] 关于转化 已有2人参与

最近做转化,第一次和第二次由于载体的问题,没有成功,在换了载体之后,蓝白斑筛选平板上居然全是白色的菌落,而且pcr鉴定后居然连接成功,真的是很诡异的事情啊,就算连接效率高,也不能全部是白斑吧,各位大神有没有相同经历啊
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让复杂的事情变简单,简单的事情更简单
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-02 13:47:27
引用回帖:
3楼: Originally posted by 静安jingan at 2012-11-01 10:55:08
问题是只是单酶切啊,纠结...

你是否把载体做了去磷酸化处理?如果这样载体不能自连,必需和插入片段连。要么就是你的目的片段也有抗性筛选基因,也可能使筛选板上基本是阳性克隆。当然,如果你的x-gal失效了的话另当别论。
4楼2012-11-01 14:04:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-02 13:47:16
当使用双酶切做连接时,如果酶切比较完全,而且连接体系载体:目的片段比例合适,阳性克隆可能接近100%。所以我只有在自连概率大的时候才做蓝白斑筛选。
2楼2012-11-01 06:59:27
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-01 06:59:27
当使用双酶切做连接时,如果酶切比较完全,而且连接体系载体:目的片段比例合适,阳性克隆可能接近100%。所以我只有在自连概率大的时候才做蓝白斑筛选。

问题是只是单酶切啊,纠结
让复杂的事情变简单,简单的事情更简单
3楼2012-11-01 10:55:08
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-01 14:04:42
你是否把载体做了去磷酸化处理?如果这样载体不能自连,必需和插入片段连。要么就是你的目的片段也有抗性筛选基因,也可能使筛选板上基本是阳性克隆。当然,如果你的x-gal失效了的话另当别论。...

额,之前做的时候也怀疑是x-gal失效了,后来换了载体就全是白斑了,pcr也有产物,就是条件老摸索不对,都做过梯度了,还是非特异性太严重
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5楼2012-11-01 17:10:22
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