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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用cDNA做PCR扩增不出来。
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六号风

新虫 (初入文坛)

[求助] 用cDNA做PCR扩增不出来。 已有3人参与

我是一名大二本科生，前两天刚开始用小木虫。想要克隆玉米的一个基因，然后把它转到拟南芥中表达，该基因的cDNA上游GC含量超高，做PCR扩增不出来。
       请问各位大佬可以用玉米的DNA做PCR吗？扩出来的序列含内含子对表达会有影响吗?
       还请大佬解释一下PCR时用cDNA和DNA做模板，两者有什么区别?

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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1楼 2017-05-02 17:18:17
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Nitara

新虫 (正式写手)
建议还用cdna  你可以设计几个退货温度梯度  试试行不

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3楼2017-05-03 07:23:47
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-02 19:27:25
如果你的基因有内含子，你用DNA做模板，扩出来的产物有内含子，一般不建议用含内含子的序列构建表达载体，因为剪接体系不完全一样，不一定能正确剪切形成和玉米里一样的成熟mRNA。
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2楼2017-05-02 18:04:56
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
GC含量高的可以用GC buffer 或者enhancer 去扩增，只是测序可能比较难测

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
9楼2017-05-03 20:56:14
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
或者使用高保真酶如kod plus neo

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
10楼2017-05-03 20:56:56
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宁文峰

新虫 (小有名气)
★
六号风(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-05 08:45:41
dna一定不行。。异源表达未必能准确切除内含子，并且也会影响目的基因的表达及其原本的功能。。说回来，拟南芥中表达也不一定能准确展现目的基因功能。。

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所追求的不在明天，而在现在以前
12楼2017-05-04 21:07:50
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宁文峰

新虫 (小有名气)
用高GC buffer进行pcr

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所追求的不在明天，而在现在以前
13楼2017-05-04 21:08:40
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宁文峰

新虫 (小有名气)
拟南芥是模式植物，用拟南芥就是考虑了周期及操作问题。。主要看你那是一个什么基因，打个比方，如果是促进纤维化 抗倒伏的基因，那在拟南芥中可能不易观察表型。。所以拟南芥适不适合还是要看那是一个什么基因。。

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所追求的不在明天，而在现在以前
15楼2017-05-05 17:55:05
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普通回帖

六号风

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Nitara at 2017-05-03 07:23:47
建议还用cdna  你可以设计几个退货温度梯度  试试行不

cDNA5'端GC含量太高了，百分之八九十，引物不好设计。

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4楼2017-05-03 08:21:14
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六号风

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2017-05-02 18:04:56
如果你的基因有内含子，你用DNA做模板，扩出来的产物有内含子，一般不建议用含内含子的序列构建表达载体，因为剪接体系不完全一样，不一定能正确剪切形成和玉米里一样的成熟mRNA。

有没有什么技术方法先用DNA扩增，再去掉内含子呢？

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5楼2017-05-03 08:25:06
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 六号风 at 2017-05-03 08:21:14
cDNA5'端GC含量太高了，百分之八九十，引物不好设计。
...

你往MRNA外面扩，ATG外面还是有序列的。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2017-05-03 08:33:08
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六号风

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 781055707 at 2017-05-03 08:33:08
你往MRNA外面扩，ATG外面还是有序列的。...

GC含量依然很高

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7楼2017-05-03 08:35:21
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vmp651312

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
请问你mRNA提取 反转录和PCR都用的什么试剂？
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8楼2017-05-03 16:46:06
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