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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录PCR
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)

[求助] 反转录PCR

本人小硕一枚，今年毕业在某科研单位工作，现在做的项目是异源表达某人源的蛋白和短肽，编码蛋白的基因长度均在4.4kb左右，GC含量均在66%左右，短肽长159bp，我做了数次反转录PCR，合成cDNA后进行PCR扩增，优化了扩增的温度，延伸时间、添加甘油及DMSO等，总是扩增不出来目的基因，即使有PCR产物也在1kb一下，不知道是为什么？是酶的问题吗？我用的是全式金快酶pfu，合成cDNA后扩增内参基因没有任何问题。请高人指点。
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1楼 2013-07-15 15:35:58
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hotpcr

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
GC含量有点高~给你推荐下阅微基因的复杂模版的2G Robust酶.
你可以打010-82162711找他们要个试用装。
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wuyuanqing
我可耐的X/Y染色体啊~
2楼2013-07-15 16:05:13
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by hotpcr at 2013-07-15 16:05:13
GC含量有点高~给你推荐下阅微基因的复杂模版的2G Robust酶.
你可以打010-82162711找他们要个试用装。

谢谢！
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3楼2013-07-15 16:16:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得可能是你的RNA样品中的基因组DNA没有消化干净，设计的引物跨内含子，所以P出来的片段比预期的大。
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wuyuanqing
4楼2013-07-16 01:29:54
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-16 01:29:54
我觉得可能是你的RNA样品中的基因组DNA没有消化干净，设计的引物跨内含子，所以P出来的片段比预期的大。

P出的片段比预期小很多。
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5楼2013-07-16 08:18:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

你是说想反转录后P出4.4kb的基因？你的短肽反转录肯定没问题，4.4kb有些长，用ogligodT可能反转录效率不高。你试试用3'特异引物反转录。
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6楼2013-07-16 11:36:51
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