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angjzy木虫 (小有名气)
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[求助]
做cDNA的PCR扩增没有结果呀！
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做了一个cDNA，用这段基因扩增actin做阳性对照，能扩增出正确片段。 说明体系、模板都没问题。 用目的基因特异引物扩增，怎么也扩不出来。 这个引物以前有师兄用过，能正确扩出目的片段。 说明引物序列没问题。 但现在我做怎么也做不出来。 怀疑引物不好用了， 就用了new aliquote 引物，还是扩不出来。 求助大虾们，这是怎么个情况呀，怎么能把它弄出来呢？ 博士刚开始，就遇到这种问题，崩溃ing~~~ [ Last edited by angjzy on 2011-10-11 at 04:33 ] |
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【答案】应助回帖
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wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-11 09:25:41
angjzy(金币+3): 太谢谢了，我试试。希望大家都顺利哈 2011-10-12 01:46:27
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-11 09:25:41
angjzy(金币+3): 太谢谢了，我试试。希望大家都顺利哈 2011-10-12 01:46:27
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呵呵 分子方面的实验就是这个样子的 总有些说不清道不明的原因 楼主这种原因我以前也经常遇到，有时候重复做几次PCR就能出来，有时候就是死命都没结果。 我的建议就是 1.先重复几次实验，有时候会由于一些比较低级的问题，比如忘加某组分，或者忘记离心，或者其他由于误差等等原因产生，会出不来结果，有时候同样的东西，做两个重复也会一个出一个不出，我把这个归结为人品不好，暴率比较低的缘故。 2.要弄清楚你扩增片段所处整个mRNA的位置，说简单点，你的ACTIN能扩出来不代表你的片段能扩增出来，特别是你如果扩增基因全长的时候，因为ACTION往往丰度高，即使有部分RNA降解也很可能有全长。另外即使没有全长ACTIN，你设计的引物如果不再整个序列的前端，这个也是说明不了模版质量的，总之actin的设计，一定要设计在序列比较靠末端的位置，用actin检测模版质量，至少需要稀释100倍检测。这个是我们实验室的玩法，非常有效.所以，你应该考虑重新提取RNA或者重新反转录试试结果。 一点个人看法，希望对你有用，祝实验成功 |
2楼2011-10-11 09:09:25