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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 同源重组载体构建
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努力奋进潇洒

金虫 (小有名气)

[交流] 同源重组载体构建

使用一步克隆法（同源重组）构建载体，经转化后能在氨苄培养皿长出上百个的菌落，菌落PCR结果显示有阳性，但是测序结果却一直不对。请各路大神指教。
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1楼 2017-04-14 10:57:52
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choujiaoqi

铁杆木虫 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你菌落 pcr引物怎么设置的？一个是 载体上，一个是 插入前段上？

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23楼2017-04-17 00:58:21
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jinnini125

木虫 (小有名气)
★
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
测序结果怎么不对？

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5楼2017-04-14 13:23:52
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)
★
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
想办法用传统的酶切间接做吧

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16楼2017-04-14 14:48:25
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xrl123

新虫 (初入文坛)
★
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
我也是这个问题啊  ，  PCR都是有条带的，大小和我目的片段差不多，  用通用引物测序，结果比对相似度40%，只有两端序列几十bp相同，包含了我加上去的酶切位点，但是中间序列都不同。有没有人知道为什么啊
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17楼2017-04-14 15:41:03
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)
★
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
可以提取质粒去测序，看看，或者另外设计引物再做PCR

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18楼2017-04-14 15:54:01
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
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19楼2017-04-15 22:56:23
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露娜823

新虫 (初入文坛)
★
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
你空白对照长了吗？

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20楼2017-04-16 13:55:08
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看你那样傻

新虫 (初入文坛)
★
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
1楼: Originally posted by 努力奋进潇洒 at 2017-04-14 10:57:52
使用一步克隆法（同源重组）构建载体，经转化后能在氨苄培养皿长出上百个的菌落，菌落PCR结果显示有阳性，但是测序结果却一直不对。请各路大神指教。

菌液pcr有没有带

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21楼2017-04-16 19:55:25
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shenshou167

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
测序结果有什么不对？

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22楼2017-04-16 23:22:04
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choujiaoqi

铁杆木虫 (知名作家)
还有，突变也是正常的，可以考虑 扩增的时候用 高保真酶

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24楼2017-04-17 00:59:09
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by xrl123 at 2017-04-14 15:41:03
我也是这个问题啊  ，  PCR都是有条带的，大小和我目的片段差不多，  用通用引物测序，结果比对相似度40%，只有两端序列几十bp相同，包含了我加上去的酶切位点，但是中间序列都不同。有没有人知道为什么啊

pcr非特异性扩增，考虑优化反应体系

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25楼2017-04-17 01:02:15
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pyj809132105

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问楼主 同源重组法怎么构建载体？最近想做，可是一头雾水

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26楼2017-08-30 23:13:04
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hzau103

新虫 (正式写手)
假阳性

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27楼2017-08-31 09:00:16
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hzau103

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by pyj809132105 at 2017-08-30 23:13:04
请问楼主 同源重组法怎么构建载体？最近想做，可是一头雾水

有一步克隆试剂盒 按说明书来做

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28楼2017-08-31 09:00:53
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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29楼2017-09-08 10:52:33
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吕葱葱同学

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我经常用同源重组构建质粒，一般板子上长10个菌以下，阳性率50％~80％

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30楼2017-11-24 18:13:44
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吕葱葱同学

新虫 (初入文坛)
用的诺唯赞同源重组试剂盒，单片段多片段均用过，四个片段连接效率较低，两个片段连接那是效率很高一连一个准

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31楼2017-11-24 18:15:15
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吕葱葱同学

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌落PCR阳性不能说明什么问题，因为可能是假阳性。同源重组成功的基础是，你的重组片段纯度很好，浓度测量要准确，我一般在连接前会把各个片段再跑一次胶看看目的条带是否单一且亮，你得载体片段扩增下来后必须用DpnI消化载体质粒的模板，减少在板子上长出来的空质粒

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32楼2017-11-24 18:24:24
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ylbing

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个可以直接交给公司做啊，很多公司做这个，又不贵
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33楼2017-11-25 23:24:03
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丑橘不知火

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一般遇到这种问题的时候，你需要从头思考，排除细节。

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34楼2017-11-26 09:17:59
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每力小刺猬

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
37楼2018-07-07 21:52:48
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840869945

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
32楼: Originally posted by 吕葱葱同学 at 2017-11-24 18:24:24
菌落PCR阳性不能说明什么问题，因为可能是假阳性。同源重组成功的基础是，你的重组片段纯度很好，浓度测量要准确，我一般在连接前会把各个片段再跑一次胶看看目的条带是否单一且亮，你得载体片段扩增下来后必须用Dp ...

大佬，想请问一下，我现有一个4500bp左右质粒，想利用同源重组插入一个EGFP片段，大概700bp，用这个质粒分别P两个片段，一个EGFP 700bp，一个骨架 4000bp,50ul体系PCR之后跑胶条带在预期位置，很亮且单一，切胶后同时做胶回收，回收产物测定浓度，700的那个有320ng/ul，有单一峰；4000的那个浓度只有13ng/ul且无峰？？重复2次，还是同样的结果，都是超低浓度且无峰值，没办法了就用乙醇沉淀回收，浓度很高但有较多杂质，将以上两个片段经同源重组酶重组后转化大肠杆菌，转出来的都是模板质粒菌，用DpnI消化载体质粒的模板后，再做出来的基本是个阴性板了，求大神指点到底是哪里出了问题，跪谢
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38楼2018-08-16 12:28:09
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纳米材料7532楼
2017-04-14 11:21   回复  
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
你在思念谁3楼
2017-04-14 11:21   回复  
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
n 发自小木虫Android客户端
gengxin604楼
2017-04-14 11:26   回复  
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
祝福
不闹眼子的我6楼
2017-04-14 13:40   回复  
努力奋进潇洒(金币+1): 谢谢参与
祝福 发自小木虫IOS客户端
也是小白7楼
2017-04-14 13:59   回复  
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paperhunter8楼
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syhorchid9楼
2017-04-14 14:19   回复  
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tzynew10楼
2017-04-14 14:24   回复  
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龙飞哥11楼
2017-04-14 14:27   回复  
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nono200912楼
2017-04-14 14:28   回复  
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田园STYLE13楼
2017-04-14 14:29   回复  
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xxl520zry14楼
2017-04-14 14:35   回复  
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幸运观众15楼
2017-04-14 14:44   回复  
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^_^ 发自小木虫IOS客户端
cl2_200735楼
2017-12-18 15:27   回复  
cl2_200736楼
2018-01-07 00:01   回复  
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