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铁虫 (初入文坛)

[求助] 怎么使线性腺病毒基因组环化？如果采用同源重组的方法，右侧同源臂只有200bp够么？

要构建一个新的腺病毒载体,可是基因组是线性的，怎么将大肠杆菌的复制原点和抗性基因加入基因组中去，并实现基因组的环化呢？
我看到的文献大概有三种方法

①先通过酶切加上复制原点和抗性基因，然后导入鼠婴肾细胞，实现自发环化，这种环化质粒好获得吗？

②将第一种方法的酶切步骤替换为同源重组，也就是说用同源重组的方法，将复制原点和抗性基因重组到腺病毒基因组中去，同时实现某些非必须基因的删除，然后再导入鼠婴肾细胞，实现环化。用这种方法的话，同源重组后的腺病毒怎么筛选？

③从腺病毒两端各取一部分作为同源臂，同源臂之间装载复制原点和抗性基因，构建穿梭质粒。将穿梭质粒线性化以后，和腺病毒基因组同时导入BJ5183细菌中，通过同源重组的方法直接环化。

我们现在正在试图采用第三种方法，不过文献中设计的左侧同源臂有2800bp，而右侧同源臂只有200bp，是不是有点短？感觉不是很靠谱啊？？

另外，从PET载体上扩增下来的pBR322+kana R基因能直接转T载体吗？一个质粒可以有两个大肠杆菌复制原点吗？

内容有点多，希望知道的同僚给予帮助，只回答一部分问题也万分感激！！！！

1楼 2015-04-17 15:11:44

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