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金虫 (小有名气)

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[交流] 同源重组载体构建

使用一步克隆法（同源重组）构建载体，经转化后能在氨苄培养皿长出上百个的菌落，菌落PCR结果显示有阳性，但是测序结果却一直不对。请各路大神指教。

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1楼2017-04-14 10:57:52

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840869945

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

32楼: Originally posted by 吕葱葱同学 at 2017-11-24 18:24:24
菌落PCR阳性不能说明什么问题，因为可能是假阳性。同源重组成功的基础是，你的重组片段纯度很好，浓度测量要准确，我一般在连接前会把各个片段再跑一次胶看看目的条带是否单一且亮，你得载体片段扩增下来后必须用Dp ...

大佬，想请问一下，我现有一个4500bp左右质粒，想利用同源重组插入一个EGFP片段，大概700bp，用这个质粒分别P两个片段，一个EGFP 700bp，一个骨架 4000bp,50ul体系PCR之后跑胶条带在预期位置，很亮且单一，切胶后同时做胶回收，回收产物测定浓度，700的那个有320ng/ul，有单一峰；4000的那个浓度只有13ng/ul且无峰？？重复2次，还是同样的结果，都是超低浓度且无峰值，没办法了就用乙醇沉淀回收，浓度很高但有较多杂质，将以上两个片段经同源重组酶重组后转化大肠杆菌，转出来的都是模板质粒菌，用DpnI消化载体质粒的模板后，再做出来的基本是个阴性板了，求大神指点到底是哪里出了问题，跪谢