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syn1985木虫 (正式写手)
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[求助]
求助链霉菌基因敲除同源重组的方法
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我之前用in frame deletion方法构建了基因敲除载体 然后将载体用结合转移的方法转到链霉菌中去了，长出了很多接合子，但是我做传代后挑10个克隆 用PCR鉴定全为野生型，我也抑郁，不知道怎么办 我想重新构建敲除载体，在中间加上抗生素的筛选标记，但是又担心抗生素加进去后会产生极性效应，所以很苦恼，老板催的紧，做不出来就被骂，很抑郁，  大家有没有什么好的建议啊 我该怎么办啊  |
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srlee
铁杆木虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+4): 很专业啊！ 2012-02-09 20:18:30
syn1985(金币+20): ★★★很有帮助 一直都是请教您 谢谢了 2012-02-10 08:56:53
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syn1985(金币+20): ★★★很有帮助 一直都是请教您 谢谢了 2012-02-10 08:56:53
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1）In-frame deletion 拿到双交换的机率较低一些，挑10个20个是WT很正常，但多筛选一些，做出来也不是很难的事。 2）如果用抗性基因阻断的话，后续筛选方便，也会很快拿到突变株的。至于polar effect，拿到突变株后做一个回补实验从而排除是极性效应的影响，很多文章中都是这么干的。 3）做实验哪可能都是那么顺利的呢？再郁闷也解决不了问题呀，还是好好整理一下自己的思路，多看一点文献找找方法，以平静的心态去做实验也许就会有转机！ 祝实验顺利！ |
2楼2012-02-09 18:52:53