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安静的啊啊啊

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR一直P不出产物，求各位大神一起帮我来找原因？ 已有6人参与

1. 模板是pcDNA3FLAG3-clk，是从其他实验室借来的，没有测序过，但师姐曾成功表达出蛋白。提质粒后，跑胶检测模板是是纯的。
  2. 引物设计后找好几个师姐看过，没有问题
  3. 阳性对照有条带
  4. 模板浓度165ug/ml, 引物浓度25uM
  25ul体系：5 X HF          5
                     3' Primer        1
                     5' Primer        1
                     10 X dNTP    1
                     Template       0.5
                     DMSO           1
                     Fusion           0.5
                     ddH2O          14.5
  5. 目的基因1455bp, 延长时间1分30秒，循环30次[wmv][/wmv]
  6. 附件图片 从左至右分别是 PCR sample, PCR sample 2,  postive control,  marker,  template
    sample1 和 sample2 反应体系完全相同， 位于PCR 机子的位置不同
    postive control 片段大小正确
请求各位大神帮着找找原因啊，做不出来已经快要疯掉了

PCR一直P不出产物，求各位大神一起帮我来找原因？
user 2017-02-06 16hr 53min clk PCR.jpg
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1楼 2017-02-08 15:39:33
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6_pengfei

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我分析一下：首先如果你的阳性对照和扩增样本用同一体系（包括模板浓度和引物），阳性对照扩出来，你的目标样本没有扩出来，说明体系没有问题（包括退火、延伸、模板量、延伸时间等）那唯一出问题的就在你的样本上，再看扩增条带一片糊，要么就是没有特异性，要么就是有其他物质影响扩增。不特异是不是你的样本不对（给你的不是你要的或他们改造过），如果这个问题排除，可能你抽提质粒的过程中有问题，重新抽提质粒，注意盐离子和乙醇挥发。我自己的一点判断，如果不对勿喷。
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努力精修
10楼2017-02-10 11:37:05
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yanlijuan

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
dna template 浓度太大了吧？

发自小木虫IOS客户端
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2楼2017-02-08 15:51:44
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安静的啊啊啊

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yanlijuan at 2017-02-08 15:51:44
dna template 浓度太大了吧？

你都用多少的啊？
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3楼2017-02-08 15:54:47
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yanlijuan

新虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-02-08 21:26:33
引用回帖:
3楼: Originally posted by 安静的啊啊啊 at 2017-02-08 15:54:47
你都用多少的啊？...

你去看你的用的酶的说明书，上面有一个dna模版做pcr适宜的浓度范围。从你的胶上看，dna浓度很大，而且有点降解了…你根据要求稀释一下dna，再试试！

发自小木虫IOS客户端
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4楼2017-02-08 17:16:06
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