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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR一直P不出产物，求各位大神一起帮我来找原因？
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安静的啊啊啊

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR一直P不出产物，求各位大神一起帮我来找原因？ 已有6人参与

1. 模板是pcDNA3FLAG3-clk，是从其他实验室借来的，没有测序过，但师姐曾成功表达出蛋白。提质粒后，跑胶检测模板是是纯的。
  2. 引物设计后找好几个师姐看过，没有问题
  3. 阳性对照有条带
  4. 模板浓度165ug/ml, 引物浓度25uM
  25ul体系：5 X HF          5
                     3' Primer        1
                     5' Primer        1
                     10 X dNTP    1
                     Template       0.5
                     DMSO           1
                     Fusion           0.5
                     ddH2O          14.5
  5. 目的基因1455bp, 延长时间1分30秒，循环30次[wmv][/wmv]
  6. 附件图片 从左至右分别是 PCR sample, PCR sample 2,  postive control,  marker,  template
    sample1 和 sample2 反应体系完全相同， 位于PCR 机子的位置不同
    postive control 片段大小正确
请求各位大神帮着找找原因啊，做不出来已经快要疯掉了

PCR一直P不出产物，求各位大神一起帮我来找原因？
user 2017-02-06 16hr 53min clk PCR.jpg
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1楼 2017-02-08 15:39:33
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yanlijuan

新虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-02-08 21:26:33
引用回帖:
3楼: Originally posted by 安静的啊啊啊 at 2017-02-08 15:54:47
你都用多少的啊？...

你去看你的用的酶的说明书，上面有一个dna模版做pcr适宜的浓度范围。从你的胶上看，dna浓度很大，而且有点降解了…你根据要求稀释一下dna，再试试！

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4楼2017-02-08 17:16:06
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yanlijuan

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
dna template 浓度太大了吧？

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2楼2017-02-08 15:51:44
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安静的啊啊啊

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yanlijuan at 2017-02-08 15:51:44
dna template 浓度太大了吧？

你都用多少的啊？
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3楼2017-02-08 15:54:47
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sweetcoffei

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
阳性对照有明显的带，说明整个反应体系没有问题，从图中PCR结果可以看出较为明显的模板带，而没有目的带，可能原因为：1。模板浓度过高，可能因为杂质等导致PCR效率降低，因此没有目的带；2。延伸时间是否可以加长为3分钟，可能由于反应体系非最佳，1分钟时间不足以形成目的带。3。退火温度可否适当降低，因为各种原因，引物并没有与模板完成退火，因此没有目的带
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5楼2017-02-09 09:08:33
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