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tianhuijuan金虫 (小有名气)
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[求助]
nested-PCR 怎样提高特异性
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最近一直在做nest-PCR，产物特异性一直上不去。很是纠结：第一次p出的产物切胶回收后，稀释5倍取1微升做模板二次PCR,结果和第一次差不多，没有出现条带，仍是smear，几乎和第一次P的结果一样。 第一次P用的模板是提取的总RNA转录为双链DNA后，与Adaptor（之前实验室用的能成功的序列）链接。（除根据Adaptor设计的两条引物外的两条引物是由三个物种的同源性手动设计的。） 两次PCR都进行了退火温度和时间，及循环数的优化，也进行过TD-PCR（间隔1度 2度都试过 ），结果仍变化不大。 PS：模板在与Adaptor连接前用其他引物验证过，有条带。 1. 连接后有smear，应该算是连接成功了吧？ 2. 试剂盒Taq & Pfu 的都试过，结果是一样。那应该是引物的问题？但是不可能引物都出问题啊？ 恳求各位虫虫帮忙啦. |
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