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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接转化后平板不长菌
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布丁褚仔

新虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化后平板不长菌 已有1人参与

质粒5k，基因1.5k，因为之前做也一直长不出来，就换了种方法，重新提了质粒，然后直接用酶切好的质粒和pcr的基因连。质粒浓度是 17.8 基因浓度是  8 连接体系是
质粒 5.5ul
基因 8ul
5×CEⅡBuffer 4ul  
ExnaseⅡ 2ul
ddH2O 0.5ul  
按照说明书是37℃半小时连接
对照组只有质粒，（加了感受态）转化时的感受态是直接买的，转化效果很好，转化是冰上半小时，42℃水浴1分钟，冰上2分钟，摇床200转1小时，结果感受态和对照组都没长，这是什么原因呀，多次重复后都没结果
【之前的方法是将双酶切的基因和质粒连接，基因浓度估计10，质粒30，连接时两者摩尔，比例是7，连4小时，转化的方法一样，但是感受态和对照组都没长】


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1楼 2016-12-13 20:01:25
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布丁褚仔

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 淇淇cotton at 2016-12-13 22:47:20
摇床摇的时候是不加抗生素的。你加了吗？

没有啊，只加了培养基

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6楼2016-12-14 12:13:59
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淇淇cotton

新虫 (小有名气)
摇床摇的时候是不加抗生素的。你加了吗？

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2楼2016-12-13 22:47:20
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-14 22:30:29
对照组都没长，应该是在转化这一步出问题了。试着热激时间延长30s,摇床100rpm左右就行，复苏用的培养基不要加抗生素。

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
3楼2016-12-13 23:48:59
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

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引用回帖:
3楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-13 23:48:59
对照组都没长，应该是在转化这一步出问题了。试着热激时间延长30s,摇床100rpm左右就行，复苏用的培养基不要加抗生素。

重复再做一次看看，转化这一步很重要的。

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
4楼2016-12-13 23:49:36
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