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li-spring

木虫 (著名写手)

[交流] 连接转化

本人用Pet30质粒作载体，选择Nco1、BamH1作双酶切，然后连接1000bp左右的基因片段，转化DH5a菌，前后做了六次了，要么平板上就不长菌，要么就长的很慢，48小时后才出现很小的菌落，第三次挑了12个菌，到液体LB里面也足足长了48小时才出来，提了质粒后发现目的片段几乎没有，请教各位大虾怎么办？ 感受态是买的新的
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1楼 2012-02-26 10:43:44
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+1): 希望不是 2012-02-26 19:34:13
是不是你的基因表达蛋白对感受态细胞来说是一种毒蛋白啊
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2楼2012-02-26 13:37:47
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+2): 学习下 2012-02-26 19:34:42
li-spring(金币+2): 转化的菌生长速度超慢，要足足两天才能长起来是怎么回事啊 2012-02-26 21:30:23
首先，你挑的菌空质粒能提出来吗？
如果空载体转进去的都很少，那说明可能是感受态或者是连接有问题~~~
楼上说蛋白有毒性，个人并不赞同，因为pETz做表达应该用BL21才对，不是用DH5a，楼主显然只是想让质粒在DH5a菌里面保存，并不是做表达~~~
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3楼2012-02-26 14:07:19
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青菜小虫

银虫 (著名写手)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+1): 有道理 2012-02-26 19:34:57
借一个感受态做个对照实验，新买的也不一定是好用的。
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4楼2012-02-26 15:08:25
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panda73

金虫 (小有名气)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+1): 抗性搞错了？？ 2012-02-26 19:35:24
pET30是卡那抗性，你没搞错吧
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5楼2012-02-26 15:16:53
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li-spring

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by joan198108 at 2012-02-26 13:37:47:
是不是你的基因表达蛋白对感受态细胞来说是一种毒蛋白啊

还没有诱导表达的啊，现在做到DH5a里的
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6楼2012-02-26 21:27:13
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li-spring

木虫 (著名写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-02-26 14:07:19:
首先，你挑的菌空质粒能提出来吗？
如果空载体转进去的都很少，那说明可能是感受态或者是连接有问题~~~
楼上说蛋白有毒性，个人并不赞同，因为pETz做表达应该用BL21才对，不是用DH5a，楼主显然只是想让质粒在DH ...

有两个提出来了，但条带大小不对，感觉是空载体，还有 转化的菌一般过夜就长出来，我这个足足长了两天，而且菌斑很小，不晓得是什么原因，挑了12个菌，最后只有两个长出来了，质粒提了之后条带不对
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7楼2012-02-26 21:29:28
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 欢迎天使归来！ 2012-02-26 23:54:21
一般情况下，单克隆如果没有问题，就要考虑你连接的问题了‘
1：质粒和目的片段是否酶切的干净，并且保证是否纯化干净？
2：连接体系合适与否？当然了。。。这要取决于你载体的大小和基因的大小了
祝好运！
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8楼2012-02-26 21:34:46
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by li-spring at 2012-02-26 21:29:28:
有两个提出来了，但条带大小不对，感觉是空载体，还有 转化的菌一般过夜就长出来，我这个足足长了两天，而且菌斑很小，不晓得是什么原因，挑了12个菌，最后只有两个长出来了，质粒提了之后条带不对

这个搞得我也有点晕。。。。。。
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9楼2012-02-27 07:56:23
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考研生涯

金虫 (正式写手)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
质粒提出来后跑胶，由于是超螺旋可能无法判断目的基因是否插入，你可以做个菌落PcR，或者将提的质粒 单酶切以后再看看.
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10楼2012-02-27 09:44:06
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zoeye

金虫 (小有名气)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
说不定不适合转这种感受态呢 有的在DH5ALPHA里是长不起来的
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11楼2012-02-27 10:59:20
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watercity

金虫 (小有名气)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
很有可能是感受态的问题吧，最好重新用个感受态。
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12楼2012-02-27 15:04:41
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 天使托 at 2012-02-26 21:34:46:
一般情况下，单克隆如果没有问题，就要考虑你连接的问题了‘
1：质粒和目的片段是否酶切的干净，并且保证是否纯化干净？
2：连接体系合适与否？当然了。。。这要取决于你载体的大小和基因的大小了
祝好运！

你好，我近期也在做酶切连接，请问怎样验证质粒和目的片段是否酶切干净？
谢谢
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13楼2012-03-03 20:02:30
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
建议你把抗生素的浓度降低，不长菌有可能是筛选压力太大了，长了很久的可能是突变的菌，所以你挑出来也没有
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14楼2012-03-04 14:01:44
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