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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化
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li-spring

木虫 (著名写手)

[交流] 连接转化

本人用Pet30质粒作载体，选择Nco1、BamH1作双酶切，然后连接1000bp左右的基因片段，转化DH5a菌，前后做了六次了，要么平板上就不长菌，要么就长的很慢，48小时后才出现很小的菌落，第三次挑了12个菌，到液体LB里面也足足长了48小时才出来，提了质粒后发现目的片段几乎没有，请教各位大虾怎么办？ 感受态是买的新的
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1楼 2012-02-26 10:43:44
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 欢迎天使归来！ 2012-02-26 23:54:21
一般情况下，单克隆如果没有问题，就要考虑你连接的问题了‘
1：质粒和目的片段是否酶切的干净，并且保证是否纯化干净？
2：连接体系合适与否？当然了。。。这要取决于你载体的大小和基因的大小了
祝好运！
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8楼2012-02-26 21:34:46
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+1): 希望不是 2012-02-26 19:34:13
是不是你的基因表达蛋白对感受态细胞来说是一种毒蛋白啊
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2楼2012-02-26 13:37:47
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+2): 学习下 2012-02-26 19:34:42
li-spring(金币+2): 转化的菌生长速度超慢，要足足两天才能长起来是怎么回事啊 2012-02-26 21:30:23
首先，你挑的菌空质粒能提出来吗？
如果空载体转进去的都很少，那说明可能是感受态或者是连接有问题~~~
楼上说蛋白有毒性，个人并不赞同，因为pETz做表达应该用BL21才对，不是用DH5a，楼主显然只是想让质粒在DH5a菌里面保存，并不是做表达~~~
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3楼2012-02-26 14:07:19
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青菜小虫

银虫 (著名写手)
★
li-spring(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+1): 有道理 2012-02-26 19:34:57
借一个感受态做个对照实验，新买的也不一定是好用的。
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4楼2012-02-26 15:08:25
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