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li-spring

木虫 (著名写手)

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[交流] 连接转化

本人用Pet30质粒作载体，选择Nco1、BamH1作双酶切，然后连接1000bp左右的基因片段，转化DH5a菌，前后做了六次了，要么平板上就不长菌，要么就长的很慢，48小时后才出现很小的菌落，第三次挑了12个菌，到液体LB里面也足足长了48小时才出来，提了质粒后发现目的片段几乎没有，请教各位大虾怎么办？感受态是买的新的

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1楼 2012-02-26 10:43:44

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li-spring

木虫 (著名写手)

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引用回帖:

楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-02-26 14:07:19:
首先，你挑的菌空质粒能提出来吗？
如果空载体转进去的都很少，那说明可能是感受态或者是连接有问题~~~
楼上说蛋白有毒性，个人并不赞同，因为pETz做表达应该用BL21才对，不是用DH5a，楼主显然只是想让质粒在DH ...

有两个提出来了，但条带大小不对，感觉是空载体，还有转化的菌一般过夜就长出来，我这个足足长了两天，而且菌斑很小，不晓得是什么原因，挑了12个菌，最后只有两个长出来了，质粒提了之后条带不对