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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 转化BL21(DE32),涂含氨苄平板，37度培养，菌长的特别少，几个。。。求大神分析原因
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小七sev7en

新虫 (初入文坛)

[求助] 转化BL21(DE32),涂含氨苄平板，37度培养，菌长的特别少，几个。。。求大神分析原因 已有9人参与

做原核表达，双酶切后，目的基因与载体连接，过夜连接，转化BL21，冰上放30min，热激90s，静止3min。加800ul不含氨苄培养基，37度，220rpm摇菌40min，涂含氨苄的平板，37度培养16小时以上。。问题来了。。菌落经常长的很少，一两个，但是偶尔也会有一两次长的多些。。。。怎么回事？？
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1楼 2014-11-25 17:28:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:10:18
一般连接产物不会直接转化表达宿主，而是前转到JM109等宿主，验证正确后再转BL21。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-11-26 08:32:50
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只不过是转化效率的问题
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9楼2014-11-28 11:32:38
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普通回帖

天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:02:32
就是转化率不高。从质粒的纯度与浓度，以及载体的浓度到转化过程的每一步都会对转化率产生影响，所以在做的时候要小心。不过，只要有一个转化成功就可以，我做的时候也有只有一个克隆的情况，但只要是正确的就OK。
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3楼2014-11-26 23:24:32
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小七sev7en

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-11-26 08:32:50
一般连接产物不会直接转化表达宿主，而是前转到JM109等宿主，验证正确后再转BL21。

就是转到JM109后，提取质粒，然后质粒转化BL21吧？。。。我们现在转到trans5α 应该也可以吧
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4楼2014-11-27 09:18:21
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小七sev7en

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天地一微尘 at 2014-11-26 23:24:32
就是转化率不高。从质粒的纯度与浓度，以及载体的浓度到转化过程的每一步都会对转化率产生影响，所以在做的时候要小心。不过，只要有一个转化成功就可以，我做的时候也有只有一个克隆的情况，但只要是正确的就OK。

是转化率的问题吗》？没有转化进去的话，空载体也能长成菌落吧？
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5楼2014-11-27 09:21:54
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小七sev7en at 2014-11-27 09:18:21
就是转到JM109后，提取质粒，然后质粒转化BL21吧？。。。我们现在转到trans5α 应该也可以吧...

那都可以的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2014-11-27 10:13:15
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蓝天勇士

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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感受态从-80取出来后立即链接，效率高些

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2014-11-27 10:20:49
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simengsmile

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:02:52
可以转化DH5a试试。还有就是目的片段与载体链接后电泳验证条带亮吗？不良亮的话建议转化的时候加大浓度
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8楼2014-11-27 11:07:05
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-29 20:51:08
一两个有你的阳性菌也是可以的啊，我的有时候就长四五个，一般都是阳性的。你的连接体系是多少？目的片段浓度低的话可以多加一点
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踏实
10楼2014-11-28 13:03:18
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