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sanmiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-29 20:51:19
这个原因很多,很有可能是你的感受态转化效率比较低。直接转化BL21 应该是没有什么问题的,我们也经常那么做。但是第一,得 保证感受态的转化效率;二,得是你的片段的酶切位点确定能切开,有些因为保护碱基不合适,所以酶切效率很低!还有,得用高效的连接酶啊,有些酶确实不行啊!!1
11楼2014-11-29 12:29:42
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看你这名字和专业,貌似认识啊
ControlMyself
12楼2014-11-29 14:22:08
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hmily890404

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小七sev7en at 2014-11-27 09:18:21
就是转到JM109后,提取质粒,然后质粒转化BL21吧?。。。我们现在转到trans5α 应该也可以吧...

对。我就是在用trans5α。就是要连接产物先转trans5α挑单克隆提质粒酶切或者PCR验证,正确后再转BL21。
13楼2014-11-29 20:13:08
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小七sev7en

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-28 13:03:18
一两个有你的阳性菌也是可以的啊,我的有时候就长四五个,一般都是阳性的。你的连接体系是多少?目的片段浓度低的话可以多加一点

关键是没有阳性撒、、我就是在想不长菌,或长的特比少,是因为菌死了,还是说没转化进去等等原因造成的啊
14楼2014-11-30 15:01:31
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小七sev7en

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-11-27 10:13:15
那都可以的
...

你好,我还想问下你。就是我构建32a载体后,转化到DH5α,菌液测序现在结果正确。然后我扩大培养提取质粒。浓度约为50mg/ul。然后转化BL21,但是菌液pcr老是没有任何条带。是什么原因呢??
15楼2014-12-02 21:51:31
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 小七sev7en at 2014-12-02 21:51:31
你好,我还想问下你。就是我构建32a载体后,转化到DH5α,菌液测序现在结果正确。然后我扩大培养提取质粒。浓度约为50mg/ul。然后转化BL21,但是菌液pcr老是没有任何条带。是什么原因呢??...

质粒转BL21之后有划单克隆吗?另外,你用菌液做模板不能扩增出条带,也可能是pcr系统受到影响了,试试把菌体离心下来,快抽下质粒做模板。一般很少直接用菌液pcr,平板菌落pcr倒是常用。
16楼2014-12-03 06:16:49
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快乐卿

银虫 (小有名气)

我也遇到过这种情况。在排除感受态转化效率没问题后,发现可能是因为在连接产物加入感受态时用抢吹打了几下的原因,感受态较脆弱吧。
17楼2014-12-31 16:27:07
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