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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 转化BL21(DE32),涂含氨苄平板，37度培养，菌长的特别少，几个。。。求大神分析原因
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小七sev7en

新虫 (初入文坛)

[求助] 转化BL21(DE32),涂含氨苄平板，37度培养，菌长的特别少，几个。。。求大神分析原因 已有9人参与

做原核表达，双酶切后，目的基因与载体连接，过夜连接，转化BL21，冰上放30min，热激90s，静止3min。加800ul不含氨苄培养基，37度，220rpm摇菌40min，涂含氨苄的平板，37度培养16小时以上。。问题来了。。菌落经常长的很少，一两个，但是偶尔也会有一两次长的多些。。。。怎么回事？？
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1楼 2014-11-25 17:28:39
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 小七sev7en at 2014-12-02 21:51:31
你好，我还想问下你。就是我构建32a载体后，转化到DH5α，菌液测序现在结果正确。然后我扩大培养提取质粒。浓度约为50mg/ul。然后转化BL21，但是菌液pcr老是没有任何条带。是什么原因呢？？...

质粒转BL21之后有划单克隆吗？另外，你用菌液做模板不能扩增出条带，也可能是pcr系统受到影响了，试试把菌体离心下来，快抽下质粒做模板。一般很少直接用菌液pcr，平板菌落pcr倒是常用。
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16楼2014-12-03 06:16:49
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:10:18
一般连接产物不会直接转化表达宿主，而是前转到JM109等宿主，验证正确后再转BL21。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-11-26 08:32:50
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:02:32
就是转化率不高。从质粒的纯度与浓度，以及载体的浓度到转化过程的每一步都会对转化率产生影响，所以在做的时候要小心。不过，只要有一个转化成功就可以，我做的时候也有只有一个克隆的情况，但只要是正确的就OK。
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3楼2014-11-26 23:24:32
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小七sev7en

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-11-26 08:32:50
一般连接产物不会直接转化表达宿主，而是前转到JM109等宿主，验证正确后再转BL21。

就是转到JM109后，提取质粒，然后质粒转化BL21吧？。。。我们现在转到trans5α 应该也可以吧
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4楼2014-11-27 09:18:21
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