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小七sev7en

新虫 (初入文坛)

[求助] 转化BL21(DE32),涂含氨苄平板,37度培养,菌长的特别少,几个。。。求大神分析原因 已有9人参与

做原核表达,双酶切后,目的基因与载体连接,过夜连接,转化BL21,冰上放30min,热激90s,静止3min。加800ul不含氨苄培养基,37度,220rpm摇菌40min,涂含氨苄的平板,37度培养16小时以上。。问题来了。。菌落经常长的很少,一两个,但是偶尔也会有一两次长的多些。。。。怎么回事??
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simengsmile

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:02:52
可以转化DH5a试试。还有就是目的片段与载体链接后电泳验证条带亮吗?不良亮的话建议转化的时候加大浓度
8楼2014-11-27 11:07:05
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-26 10:10:18
一般连接产物不会直接转化表达宿主,而是前转到JM109等宿主,验证正确后再转BL21。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2014-11-26 08:32:50
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小七sev7en(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-27 20:02:32
就是转化率不高。从质粒的纯度与浓度,以及载体的浓度到转化过程的每一步都会对转化率产生影响,所以在做的时候要小心。不过,只要有一个转化成功就可以,我做的时候也有只有一个克隆的情况,但只要是正确的就OK。
3楼2014-11-26 23:24:32
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小七sev7en

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-11-26 08:32:50
一般连接产物不会直接转化表达宿主,而是前转到JM109等宿主,验证正确后再转BL21。

就是转到JM109后,提取质粒,然后质粒转化BL21吧?。。。我们现在转到trans5α 应该也可以吧
4楼2014-11-27 09:18:21
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