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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切 胶回收
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切 胶回收 已有5人参与

质粒提取后双酶切4h，跑胶后，条带很暗，但是切来了，胶回收浓度很低，是胶回收的不好吗，道友指导一下，怎么办？

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1楼 2016-07-31 21:48:22
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xiaoxulittle

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-01 07:25:31
用的什么内切酶，切这么久？初始质粒有多少？MARKER条带如何？可否给个图？

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2楼2016-07-31 22:20:10
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Yuanfang_818

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoxulittle at 2016-07-31 22:20:10
用的什么内切酶，切这么久？初始质粒有多少？MARKER条带如何？可否给个图？

用的内切酶是Sac l和Hind lll，实验室一般是酶切4h，他们做的也不是很亮。质粒，20的体系加1ug，50的体系加1.5ug，好像20的体系要好一些。跑胶后，大片段很亮，我要的小片段不亮。也可能我胶回收的不好，自己觉得胶溶解的时间有点长了，其他的应该没啥了。

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3楼2016-08-01 08:21:44
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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Yuanfang_818: 金币+2, ★★★很有帮助 2016-08-02 10:52:53
1、酶切时间2-3h即可
2、加大酶切的样品量
3、电泳时间不需要i太长，只要能分开条带即可
4、回收一般没什么问题，保证按步骤操作即可
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4楼2016-08-01 11:02:00
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+2, ★★★很有帮助 2016-08-02 10:53:24
你都说了，条带很暗，估计回收出来浓度也不会太高~以后酶切的时候在不超量的情况下尽量多加点质粒，切时间长点也没关系的，这样回收浓度比较高，后续实验也方便做~
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···
5楼2016-08-02 10:22:12
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swgcpy

至尊木虫 (著名写手)
快切酶37℃一小时足矣，慢切酶要比较彻底的话最好过夜。另外切完直接跑胶条带很暗的话就不是回收的问题了，是开始反应的质粒量就比较少

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6楼2016-08-03 00:25:23
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+2 2016-08-03 17:33:31
酶切后跑胶条带都不亮，会不会是你提的质粒浓度就低呀？
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7楼2016-08-03 08:54:18
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Yuanfang_818: 金币+2 2016-08-03 17:32:34
一般来说  胶回收这一步 只要按照步骤来  溶液没问题  是不会有什么问题的

我觉得可能你的酶切产物本来浓度就不高  回收后会有一点损失  所以条带不亮  多切几管吧
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8楼2016-08-03 11:11:31
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feierorange

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道你说的小片段是指多小，以我的经验，双酶切胶回收电泳时，小片段是会比较弱，如果担心的话，可以采用楼上所说多切几管。
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9楼2016-08-03 13:21:55
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