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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切
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licunyu

铁虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切 已有3人参与

最近在做双酶切（TAKARA家的Xba1/Xho1   共用Buffer为10XM）,想重新构建真核表达载体（目的片段210bp+载体）
1、双酶切（20μl体系，1-3小时都试过），只能切开Xho1位点（与分步酶切对照过）
2、分步双酶切，第一步酶切，不管先切哪个位点，跑胶检测都能切开，但是到第二步酶切结束，想切胶回收的时候，却怎么也跑不出条带来了，只是模糊的一片，像拖带一样，我的DNA去哪儿了？愁死了，求高手指点迷津，感激不尽啊，跪谢！！！

注：关于分步酶切胶回收损失的问题，我特意在第一步酶切结束后，尝试过三种方法 a、切胶回收（测得浓度为60ng左右）  b、不跑胶，直接在原体系里进行第二步酶切  c、不跑胶，直接过柱回收（切胶回收试剂盒，不是专业的DNA分离柱）
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1楼 2014-03-09 15:21:56
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
licunyu: 金币+1 2014-03-09 16:43:22
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 18:30:59
不了解你具体的实验过程，但是XbaI是有甲基化位点的，你考虑一下看看有没有中招吧。
祝你成功。
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2楼2014-03-09 16:08:26
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licunyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-09 16:08:26
不了解你具体的实验过程，但是XbaI是有甲基化位点的，你考虑一下看看有没有中招吧。
祝你成功。

是的，我也看到过关于甲基化的问题，但是我在每一次酶切以后，取小量跑胶，跟原始质粒对比，很明显是切开了。依然感谢您！
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3楼2014-03-09 16:46:09
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-10 08:27:51
licunyu: 金币+6, ★★★很有帮助 2014-03-10 08:33:08
的确很奇怪，你第二步酶切加酶量少些，酶切时间控制在30min之内，跑胶再看看有没有目的带。你把你第一次酶切回收的DNA再跑跑看，看看回收后有没有问题。
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hehe
4楼2014-03-09 21:34:20
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_hwq

新虫 (初入文坛)
试过切过夜吗

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-03-09 23:14:48
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licunyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-09 21:34:20
的确很奇怪，你第二步酶切加酶量少些，酶切时间控制在30min之内，跑胶再看看有没有目的带。你把你第一次酶切回收的DNA再跑跑看，看看回收后有没有问题。

启发很大，我意识到可能是星活性的问题，本来这个Xho1酶切割效率就高，我之前一直担心切不开而加大了酶量延长了时间，钻进了牛角尖，现在我就在第二步做几个时间梯度试试。非常感谢您！
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6楼2014-03-10 08:32:13
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licunyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by _hwq at 2014-03-09 23:14:48
试过切过夜吗

没有   因为1-3个小时已经能够切开了   我就没有做过夜切
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7楼2014-03-10 08:34:07
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xiaodebaobao

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-11 13:35:48
licunyu: 金币+1 2014-03-11 14:46:56
试一下双酶切同时进行，两种限制性内切酶应该有各自适宜的温度，在PCR仪里酶切，第一步设第一种酶的适宜温度和时间，第二步设第二种酶的适宜温度和时间，第三步设一个能让两种酶都终止反应的温度和时间。电泳检测时时间稍长一些。有条件的话可以试一下。
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8楼2014-03-11 12:56:15
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licunyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xiaodebaobao at 2014-03-11 12:56:15
试一下双酶切同时进行，两种限制性内切酶应该有各自适宜的温度，在PCR仪里酶切，第一步设第一种酶的适宜温度和时间，第二步设第二种酶的适宜温度和时间，第三步设一个能让两种酶都终止反应的温度和时间。电泳检测时 ...

说明书上都是37℃，30min，为了保证温度恒定，我就是在pcr仪里操作的，单切都能切开，但是只要两种酶切结束就跑不出条带...难道是浓度太小吗？
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9楼2014-03-11 14:46:46
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