应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切
51/1返回列表
查看: 1902  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

licunyu

铁虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切 已有3人参与

最近在做双酶切（TAKARA家的Xba1/Xho1   共用Buffer为10XM）,想重新构建真核表达载体（目的片段210bp+载体）
1、双酶切（20μl体系，1-3小时都试过），只能切开Xho1位点（与分步酶切对照过）
2、分步双酶切，第一步酶切，不管先切哪个位点，跑胶检测都能切开，但是到第二步酶切结束，想切胶回收的时候，却怎么也跑不出条带来了，只是模糊的一片，像拖带一样，我的DNA去哪儿了？愁死了，求高手指点迷津，感激不尽啊，跪谢！！！

注：关于分步酶切胶回收损失的问题，我特意在第一步酶切结束后，尝试过三种方法 a、切胶回收（测得浓度为60ng左右）  b、不跑胶，直接在原体系里进行第二步酶切  c、不跑胶，直接过柱回收（切胶回收试剂盒，不是专业的DNA分离柱）
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2014-03-09 15:21:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

licunyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xiaodebaobao at 2014-03-11 12:56:15
试一下双酶切同时进行，两种限制性内切酶应该有各自适宜的温度，在PCR仪里酶切，第一步设第一种酶的适宜温度和时间，第二步设第二种酶的适宜温度和时间，第三步设一个能让两种酶都终止反应的温度和时间。电泳检测时 ...

说明书上都是37℃，30min，为了保证温度恒定，我就是在pcr仪里操作的，单切都能切开，但是只要两种酶切结束就跑不出条带...难道是浓度太小吗？
赞一下 回复此楼
9楼2014-03-11 14:46:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
licunyu: 金币+1 2014-03-09 16:43:22
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 18:30:59
不了解你具体的实验过程，但是XbaI是有甲基化位点的，你考虑一下看看有没有中招吧。
祝你成功。
赞一下 回复此楼
2楼2014-03-09 16:08:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

licunyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-09 16:08:26
不了解你具体的实验过程，但是XbaI是有甲基化位点的，你考虑一下看看有没有中招吧。
祝你成功。

是的，我也看到过关于甲基化的问题，但是我在每一次酶切以后，取小量跑胶，跟原始质粒对比，很明显是切开了。依然感谢您！
赞一下 回复此楼
3楼2014-03-09 16:46:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-10 08:27:51
licunyu: 金币+6, ★★★很有帮助 2014-03-10 08:33:08
的确很奇怪，你第二步酶切加酶量少些，酶切时间控制在30min之内，跑胶再看看有没有目的带。你把你第一次酶切回收的DNA再跑跑看，看看回收后有没有问题。
赞一下 回复此楼
hehe
4楼2014-03-09 21:34:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 279求调剂 +3 dua1 2026-03-01 4/200 2026-03-02 00:23 by 大脸蛋子
[考研] 材料学硕318求调剂 +5 February_Feb 2026-03-01 5/250 2026-03-01 23:31 by L135790
[考研] 292求调剂 +6 yhk_819 2026-02-28 6/300 2026-03-01 23:23 by 向上的胖东
[基金申请] 成果系统访问量大，请一小时后再尝试。---NSFC啥时候好哦，已经两天这样了 +4 NSFC2026我来了 2026-02-28 4/200 2026-03-01 22:37 by 铁门栓
[考研] 0856调剂 +5 刘梦微 2026-02-28 5/250 2026-03-01 22:30 by wang_dand
[考研] 306分材料调剂 +4 chuanzhu川烛 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:48 by 无际的草原
[考研] 291分工科求调剂 +9 science饿饿 2026-03-01 10/500 2026-03-01 18:55 by 18137688336
[考研] 材料学调剂 +9 提神豆沙包 2026-02-28 11/550 2026-03-01 18:15 by ms629
[考研] 化工专硕342，一志愿大连理工大学，求调剂 +3 kyf化工 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:49 by yywzz
[考研] 313求调剂 +3 水流年lc 2026-02-28 3/150 2026-03-01 16:01 by 新能源达人
[考研] 311求调剂 +6 亭亭亭01 2026-03-01 6/300 2026-03-01 15:41 by 324616
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-02-28 7/350 2026-03-01 15:14 by wjLi2017
[考研] 课题组接收材料类调剂研究生 +3 gaoxiaoniuma 2026-02-28 4/200 2026-03-01 14:30 by jjj三跨
[考研] 295复试调剂 +3 简木ChuFront 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:27 by zzxw520th
[考研] 302材料工程求调剂 +4 Doleres 2026-03-01 5/250 2026-03-01 11:52 by liqiongjy
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧？ +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
[考研] 307求调剂 +4 73372112 2026-02-28 6/300 2026-03-01 00:04 by ll247
[考研] 304求调剂 +3 52hz~~ 2026-02-28 5/250 2026-03-01 00:00 by 52hz~~
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭