应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切
51/1返回列表
查看: 1905  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

licunyu

铁虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切 已有3人参与

最近在做双酶切（TAKARA家的Xba1/Xho1   共用Buffer为10XM）,想重新构建真核表达载体（目的片段210bp+载体）
1、双酶切（20μl体系，1-3小时都试过），只能切开Xho1位点（与分步酶切对照过）
2、分步双酶切，第一步酶切，不管先切哪个位点，跑胶检测都能切开，但是到第二步酶切结束，想切胶回收的时候，却怎么也跑不出条带来了，只是模糊的一片，像拖带一样，我的DNA去哪儿了？愁死了，求高手指点迷津，感激不尽啊，跪谢！！！

注：关于分步酶切胶回收损失的问题，我特意在第一步酶切结束后，尝试过三种方法 a、切胶回收（测得浓度为60ng左右）  b、不跑胶，直接在原体系里进行第二步酶切  c、不跑胶，直接过柱回收（切胶回收试剂盒，不是专业的DNA分离柱）
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2014-03-09 15:21:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

_hwq

新虫 (初入文坛)
试过切过夜吗

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
5楼2014-03-09 23:14:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
licunyu: 金币+1 2014-03-09 16:43:22
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 18:30:59
不了解你具体的实验过程，但是XbaI是有甲基化位点的，你考虑一下看看有没有中招吧。
祝你成功。
赞一下 回复此楼
2楼2014-03-09 16:08:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

licunyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-03-09 16:08:26
不了解你具体的实验过程，但是XbaI是有甲基化位点的，你考虑一下看看有没有中招吧。
祝你成功。

是的，我也看到过关于甲基化的问题，但是我在每一次酶切以后，取小量跑胶，跟原始质粒对比，很明显是切开了。依然感谢您！
赞一下 回复此楼
3楼2014-03-09 16:46:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-10 08:27:51
licunyu: 金币+6, ★★★很有帮助 2014-03-10 08:33:08
的确很奇怪，你第二步酶切加酶量少些，酶切时间控制在30min之内，跑胶再看看有没有目的带。你把你第一次酶切回收的DNA再跑跑看，看看回收后有没有问题。
赞一下 回复此楼
hehe
4楼2014-03-09 21:34:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0857调剂 +4 一ll半 2026-02-28 5/250 2026-03-02 02:33 by 908055542
[考研] 284求调剂 +8 天下熯 2026-02-28 8/400 2026-03-02 00:15 by 暮雨星晴
[考研] 材料学硕318求调剂 +11 February_Feb 2026-03-01 13/650 2026-03-01 23:53 by ccp273206157
[考研] 材料学硕318求调剂 +5 February_Feb 2026-03-01 5/250 2026-03-01 23:31 by L135790
[考研] 292求调剂 +6 yhk_819 2026-02-28 6/300 2026-03-01 23:23 by 向上的胖东
[考研] 江苏省农科院招调剂1名 +3 Qwertyuop 2026-03-01 3/150 2026-03-01 23:18 by aaadim
[基金申请] 成果系统访问量大，请一小时后再尝试。---NSFC啥时候好哦，已经两天这样了 +4 NSFC2026我来了 2026-02-28 4/200 2026-03-01 22:37 by 铁门栓
[考研] 0856调剂 +5 刘梦微 2026-02-28 5/250 2026-03-01 22:30 by wang_dand
[考研] 0856求调剂285 +10 吕仔龙 2026-02-28 10/500 2026-03-01 21:37 by 公瑾逍遥
[考研] 一志愿中南大学理学化学 +4 15779376950 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:00 by Fff-1
[考研] 295求调剂 +7 19171856320 2026-02-28 7/350 2026-03-01 18:54 by 18137688336
[考研] 321求调剂一志愿东北林业大学材料与化工英二数二 +4 虫虫虫虫虫7 2026-03-01 7/350 2026-03-01 16:52 by caszguilin
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-02-28 7/350 2026-03-01 15:14 by wjLi2017
[考研] 材料工程274求调剂 +3 Lilithan 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:58 by ms629
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[考研] 寻找调剂 +4 LYidhsjabdj 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:56 by sunny81
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧？ +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
[考研] 085600材料工程一志愿中科大总分312求调剂 +8 吃宵夜1 2026-02-28 10/500 2026-02-28 20:27 by L135790
[硕博家园] 【博士招生】太原理工大学2026化工博士 +4 N1ce_try 2026-02-24 8/400 2026-02-26 08:40 by N1ce_try
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭