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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近原核表达载体构建都是假阳性或阴性多，大家帮忙分析一下？
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 最近原核表达载体构建都是假阳性或阴性多，大家帮忙分析一下？ 已有3人参与

本来实验按照流程做都是很顺利的，因为都是比较简单的克隆，但最近的问题实在太多，实验一拖再拖，我都不好意思面对同事的询问了。首先实验是搬了新的实验室后开始的，有几个原料又买了新的批次
1. 连接酶：仓库送货时下面垫两个冰袋，上面叠放着几包连接酶，这样送过来，这里的温度大概28度
2. 酶切：做原核表达的pET28a载体，我用Takara的BamHI和HindIII双酶切，载体20ul，酶各1ul，buffer5ul，补水至50ul，双酶切时间分别为2，2.5，3h，跑胶发现3h的跑胶就是全部弥散的，2和2.5h的正常有条带。而用Fermentas的快速酶切，切20min，拿纯化后的载体（理论上是线性的）转化大肠杆菌，还是正常长菌，可能是有没有酶切的质粒导致的。
3. PCR产物或割胶纯化：双酶切的目的条带不弱，但纯化后拿产物去跑胶都是没有条带或很弱。
4. 连接：我们一般是1ul载体，2ul连接酶，2ul buffer，15ul PCR纯化产物
5. 感受态细胞：买回来后，仓库的同事用冰袋送过来，或者放到-20了，再给我们送过来放回-80。抗议过很多次都没效果，就用TSS法自己做感受态了
6.转化：转化后菌的大小不均一，差别挺大的，但没有拍到图。挑菌鉴定的话是大的菌落有阳性结果
7.菌液鉴定：我们都是挑菌落到LB里摇4h左右，加菌液作为模板鉴定，有定性或荧光定量的方法，根据菌液不同而不同。出现两种极端情况，一是全部阴性，但PCR纯化产物是阳性的有条带，排除了体系问题。二是全部都是强阳性例如Ct14左右，送测序都是空载体。正常来讲菌液鉴定的Ct值20左右算很正常。
8. 诱导：本来可以正常诱导的菌突然摇不起来，就是测序正确的菌株，一般1%接种量，2-3h可以到达OD0.6，加入IPTG诱导，可以得到浓度很高的蛋白，但现在是要6h才能到0.6，然后表达量比之前低了大概1000-10000倍

我自己是怀疑由于冷链的问题，导致连接酶和感受态细胞不可用或者效率低。我尝试过在OD0.2-0.3的时候诱导，是可以拿到正常浓度的蛋白。
其他方面的问题，请大家多提意见多交流，看下我们有没有改进的方面，最近实在被这个折腾惨了
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2016-05-18 11:54:22
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-05-18 16:01:20
xn8008: 应助指数+1 2016-06-26 06:45:07
1、这个一定要改，酶活性不行的话，直接影响后续工作
2、双酶切的话，酶的量1ul略多了，结合第一点，酶可能产出星号活性，所以条带弥散；
     快速酶切20min，本身就切不完全，只是能切一部分用于后续的实验
3、没纯化好
、、、、
先改掉上述情况，再看
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2楼2016-05-18 15:03:22
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yang0071

木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sxxuan at 2016-05-18 16:01:10
非常感谢
1.这个我们不能保证可以改，因为涉及到送货不是我们可以决定，现在在争取。
2.0.5ul的酶量可以？就是普通酶切还是由于快速酶切？
3.没有纯化好的话，因为是按照试剂盒步骤，不知道哪步有问题...

2  普通酶切
3  胶完全溶解了吗？洗脱前，离心完全了吗？洗脱时，洗脱液量多少，加热了吗？
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5楼2016-05-18 16:40:55
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普通回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yang0071 at 2016-05-18 15:03:22
1、这个一定要改，酶活性不行的话，直接影响后续工作
2、双酶切的话，酶的量1ul略多了，结合第一点，酶可能产出星号活性，所以条带弥散；
     快速酶切20min，本身就切不完全，只是能切一部分用于后续的实验
3、 ...

非常感谢
1.这个我们不能保证可以改，因为涉及到送货不是我们可以决定，现在在争取。
2.0.5ul的酶量可以？就是普通酶切还是由于快速酶切？
3.没有纯化好的话，因为是按照试剂盒步骤，不知道哪步有问题
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3楼2016-05-18 16:01:10
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jinfangli

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2016-05-19 09:36:55
myprayer: 金币+1, MolEPI+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-25 23:39:49
xn8008: 应助指数+1 2016-06-26 06:44:59
自己也遇到过这种很是怪异的实验结果，以前做的好好的突然怎么做都出不来的。此情况下，我主要从下面几点做起
1，全面消毒，紫外，消毒剂，摇床高温各种（很有用的，偶尔要不出来菌落，就消下毒就好了）
2，质粒重新双酶切，1h是最长时间，大于就会切杂乱，回收一定要重复过回收柱，包括洗脱，增大回收效率。
3，单菌落不均一时，重新转化，控制体系，包括质粒最多1ul到100ml感受态或者连接体系4℃连接后再转化，平板要加大营养。
4，质粒单菌落一致后才能做表达菌，此时表达菌的菌落应该是均一的，可一管中挑取多个克隆或者一整片培养。
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fight
4楼2016-05-18 16:14:06
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yang0071 at 2016-05-18 16:40:55
2  普通酶切
3  胶完全溶解了吗？洗脱前，离心完全了吗？洗脱时，洗脱液量多少，加热了吗？...

好呢，明白，我按照你的提问去了解清楚，谢谢。
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6楼2016-05-19 09:11:38
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jinfangli at 2016-05-18 16:14:06
自己也遇到过这种很是怪异的实验结果，以前做的好好的突然怎么做都出不来的。此情况下，我主要从下面几点做起
1，全面消毒，紫外，消毒剂，摇床高温各种（很有用的，偶尔要不出来菌落，就消下毒就好了）
2，质粒重 ...

我试过普通双酶切2h，纯化后直接1ul转化感受态细胞，也长菌了是否代表没有完全酶切？
连接体系20ul，一般拿10ul去转化，然后全部菌拿去涂板，是否太多？但长出来的菌落也不是很多。
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7楼2016-05-19 09:36:42
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jinfangli

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎积极回帖 2016-06-26 06:45:36
引用回帖:
7楼: Originally posted by sxxuan at 2016-05-19 09:36:42
我试过普通双酶切2h，纯化后直接1ul转化感受态细胞，也长菌了是否代表没有完全酶切？
连接体系20ul，一般拿10ul去转化，然后全部菌拿去涂板，是否太多？但长出来的菌落也不是很多。...

还是纯化后再转化的还长菌，首先看切下来的片段跟你原质粒相差多少，差的不多，那切胶就容易混，差得多，电泳多跑会就会拉开，回收就不会出问题，若这种情况都长菌，那可能是抗性出现问题，换跟此有关的试剂；
连接转化效率都有限，就是全部涂板，这个没问题，长出来一两个都是正常的。
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fight
8楼2016-05-19 11:33:49
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jinfangli

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sxxuan at 2016-05-19 09:36:42
我试过普通双酶切2h，纯化后直接1ul转化感受态细胞，也长菌了是否代表没有完全酶切？
连接体系20ul，一般拿10ul去转化，然后全部菌拿去涂板，是否太多？但长出来的菌落也不是很多。...

还是纯化后再转化的还长菌，首先看切下来的片段跟你原质粒相差多少，差的不多，那切胶就容易混，差得多，电泳多跑会就会拉开，回收就不会出问题，若这种情况都长菌，那可能是抗性出现问题，换跟此有关的试剂；
连接转化效率都有限，就是全部涂板，这个没问题，长出来一两个都是正常的。
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fight
9楼2016-05-19 11:33:56
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jinfangli at 2016-05-19 11:33:56
还是纯化后再转化的还长菌，首先看切下来的片段跟你原质粒相差多少，差的不多，那切胶就容易混，差得多，电泳多跑会就会拉开，回收就不会出问题，若这种情况都长菌，那可能是抗性出现问题，换跟此有关的试剂；
连 ...

因为切下来的片段才十几bp，确实是分不开的
我试试换个抗生素。谢谢啊真的很好的建议
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10楼2016-05-19 12:07:25
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