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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近原核表达载体构建都是假阳性或阴性多，大家帮忙分析一下？
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18862141107

新虫 (初入文坛)
Takara的BamHI和HindIII双酶切我们也经常用，我个人是0.5ul的，一直正常，其他人也有用1和1.5的，也没问题
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11楼2016-05-19 18:54:43
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 18862141107 at 2016-05-19 18:54:43
Takara的BamHI和HindIII双酶切我们也经常用，我个人是0.5ul的，一直正常，其他人也有用1和1.5的，也没问题

我是用10×K buffer，因为HindIII效率低一些，所以都用双倍
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你的日子如何，你的力量也必如何！
12楼2016-05-20 10:15:05
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啄木鸟HXH

新虫 (初入文坛)
你好，我现在也碰到类似问题，我是空pet-32a直接转DH5a怎么都不长阳性克隆，能向你请教相关问题嘛？
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13楼2016-06-25 23:09:20
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 啄木鸟HXH at 2016-06-25 23:09:20
你好，我现在也碰到类似问题，我是空pet-32a直接转DH5a怎么都不长阳性克隆，能向你请教相关问题嘛？

不好意思前段时间电脑坏了，空转都没有阳性的话，首先确认质粒有没有问题，然后是感受态细胞可以重新制备试试
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14楼2016-07-04 16:54:22
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我只回答一下8的问题，摇了6h的时候OD才到0.6,会不会是菌种在传代过程中活性降低，要不试试提质粒重新转入表达菌株，我的也遇到过类似的情况
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sxxuan
想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
15楼2016-07-04 18:19:57
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pjxiongjing

新虫 (小有名气)
请问你蛋白表达之后，后期要纯化么

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16楼2016-09-01 22:45:40
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by pjxiongjing at 2016-09-01 22:45:40
请问你蛋白表达之后，后期要纯化么

后期不做纯化了，超声破碎上清直接用

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你的日子如何，你的力量也必如何！
17楼2016-12-21 08:41:45
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sxxuan

金虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
15楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-07-04 18:19:57
我只回答一下8的问题，摇了6h的时候OD才到0.6,会不会是菌种在传代过程中活性降低，要不试试提质粒重新转入表达菌株，我的也遇到过类似的情况

我们后来做了实验发现是感受态有问题，od0.2就诱导可以恢复正常表达浓度

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你的日子如何，你的力量也必如何！
18楼2016-12-21 08:42:40
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尹俊采

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sxxuan at 2016-05-19 09:36:42
我试过普通双酶切2h，纯化后直接1ul转化感受态细胞，也长菌了是否代表没有完全酶切？
连接体系20ul，一般拿10ul去转化，然后全部菌拿去涂板，是否太多？但长出来的菌落也不是很多。...

长菌是肯定有没切好的质粒，把空质粒转进去了

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19楼2019-06-28 17:35:23
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