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sxxuan金虫 (著名写手)
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最近原核表达载体构建都是假阳性或阴性多，大家帮忙分析一下？ 已有3人参与
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本来实验按照流程做都是很顺利的，因为都是比较简单的克隆，但最近的问题实在太多，实验一拖再拖，我都不好意思面对同事的询问了。首先实验是搬了新的实验室后开始的，有几个原料又买了新的批次 1. 连接酶：仓库送货时下面垫两个冰袋，上面叠放着几包连接酶，这样送过来，这里的温度大概28度 2. 酶切：做原核表达的pET28a载体，我用Takara的BamHI和HindIII双酶切，载体20ul，酶各1ul，buffer5ul，补水至50ul，双酶切时间分别为2，2.5，3h，跑胶发现3h的跑胶就是全部弥散的，2和2.5h的正常有条带。而用Fermentas的快速酶切，切20min，拿纯化后的载体（理论上是线性的）转化大肠杆菌，还是正常长菌，可能是有没有酶切的质粒导致的。 3. PCR产物或割胶纯化：双酶切的目的条带不弱，但纯化后拿产物去跑胶都是没有条带或很弱。 4. 连接：我们一般是1ul载体，2ul连接酶，2ul buffer，15ul PCR纯化产物 5. 感受态细胞：买回来后，仓库的同事用冰袋送过来，或者放到-20了，再给我们送过来放回-80。抗议过很多次都没效果，就用TSS法自己做感受态了 6.转化：转化后菌的大小不均一，差别挺大的，但没有拍到图。挑菌鉴定的话是大的菌落有阳性结果 7.菌液鉴定：我们都是挑菌落到LB里摇4h左右，加菌液作为模板鉴定，有定性或荧光定量的方法，根据菌液不同而不同。出现两种极端情况，一是全部阴性，但PCR纯化产物是阳性的有条带，排除了体系问题。二是全部都是强阳性例如Ct14左右，送测序都是空载体。正常来讲菌液鉴定的Ct值20左右算很正常。 8. 诱导：本来可以正常诱导的菌突然摇不起来，就是测序正确的菌株，一般1%接种量，2-3h可以到达OD0.6，加入IPTG诱导，可以得到浓度很高的蛋白，但现在是要6h才能到0.6，然后表达量比之前低了大概1000-10000倍 我自己是怀疑由于冷链的问题，导致连接酶和感受态细胞不可用或者效率低。我尝试过在OD0.2-0.3的时候诱导，是可以拿到正常浓度的蛋白。 其他方面的问题，请大家多提意见多交流，看下我们有没有改进的方面，最近实在被这个折腾惨了 |
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9楼2016-05-19 11:33:56
yang0071
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2楼2016-05-18 15:03:22
sxxuan
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3楼2016-05-18 16:01:10
【答案】应助回帖
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自己也遇到过这种很是怪异的实验结果，以前做的好好的突然怎么做都出不来的。此情况下，我主要从下面几点做起 1，全面消毒，紫外，消毒剂，摇床高温各种（很有用的，偶尔要不出来菌落，就消下毒就好了） 2，质粒重新双酶切，1h是最长时间，大于就会切杂乱，回收一定要重复过回收柱，包括洗脱，增大回收效率。 3，单菌落不均一时，重新转化，控制体系，包括质粒最多1ul到100ml感受态或者连接体系4℃连接后再转化，平板要加大营养。 4，质粒单菌落一致后才能做表达菌，此时表达菌的菌落应该是均一的，可一管中挑取多个克隆或者一整片培养。 |
4楼2016-05-18 16:14:06
