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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pET-28a NdeI XhoI 双酶切后电泳4条带 重复3次都一样
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dinding

金虫 (小有名气)

[求助] pET-28a NdeI XhoI 双酶切后电泳4条带 重复3次都一样 已有3人参与

最近在做原核表达，用pET-28a构建表达载体，选用的是NdeI XhoI这两个内切酶（fermentas），50体系是pET-28a空质粒10ug，NdeI 0.25ul，XhoI 0.25ul，buffer o 5ul，第一次切了一夜，电泳有4条带，在5000bp上下各有一条较亮的条带，其他还有两条较弱的条带，以为是切的时间过长；第二次切了5个小时，电泳，还是一样的情况；第三次只切了2小时不到，电泳还是一样的情况；按到了内切酶并不多，实在搞不清什么情况，真心希望大家帮忙分析下怎么办？谢谢~~
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1楼 2014-06-26 10:11:35
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-26 13:18:06
空载跑个对照看看，是不是载体有问题
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2楼2014-06-26 10:44:45
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
50ul体系，酶只加0.25ul？会不会太少了？我最近也在构28a的载体，切的也比较奇怪，切完后比空载跑的还快，不知道怎么回事

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
3楼2014-06-29 00:33:24
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:56:44
50Ul体系中我都是内切酶各加2ul，10*buffer加5ul
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4楼2014-06-29 07:21:44
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smdsfy

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-15 15:56:53
引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-06-29 00:33:24
50ul体系，酶只加0.25ul？会不会太少了？我最近也在构28a的载体，切的也比较奇怪，切完后比空载跑的还快，不知道怎么回事

正常质粒是闭合的双链DNA。在电泳过程中可能使质粒发生开环，或者由开环解开螺旋变成线形。这三种形态电泳时的分离率不同，分离速度不同，分成三带。闭环（超螺旋），开环，线形的螺旋率依次降低。（开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链，因此电泳速度最慢）三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是搜索超螺旋>线形>开环，线形的质粒在中间，而开环的质粒在最后。判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。
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5楼2014-07-01 15:19:07
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-06-29 00:33:24
50ul体系，酶只加0.25ul？会不会太少了？我最近也在构28a的载体，切的也比较奇怪，切完后比空载跑的还快，不知道怎么回事

pET28a质粒提取出来之后，双酶切之后正常是不是有两条带？是不是要保证检测之后正确才能与目的基因进行连接？谢谢！
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
6楼2015-01-15 10:31:26
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你可以做个对照，酶加1ul，分别做单酶切、双酶切、对照、看看什么情况吧。
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7楼2015-01-15 13:40:45
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