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dinding

金虫 (小有名气)

[求助] pET-28a NdeI XhoI 双酶切后电泳4条带 重复3次都一样已有3人参与

最近在做原核表达,用pET-28a构建表达载体,选用的是NdeI XhoI这两个内切酶(fermentas),50体系是pET-28a空质粒10ug,NdeI 0.25ul,XhoI 0.25ul,buffer o 5ul,第一次切了一夜,电泳有4条带,在5000bp上下各有一条较亮的条带,其他还有两条较弱的条带,以为是切的时间过长;第二次切了5个小时,电泳,还是一样的情况;第三次只切了2小时不到,电泳还是一样的情况;按到了内切酶并不多,实在搞不清什么情况,真心希望大家帮忙分析下怎么办?谢谢~~
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-06-26 13:18:06
空载跑个对照看看,是不是载体有问题
2楼2014-06-26 10:44:45
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

50ul体系,酶只加0.25ul?会不会太少了?我最近也在构28a的载体,切的也比较奇怪,切完后比空载跑的还快,不知道怎么回事

[ 发自小木虫客户端 ]
天道酬勤
3楼2014-06-29 00:33:24
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yzj926521

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2014-07-15 15:56:44
50Ul体系中我都是内切酶各加2ul,10*buffer加5ul
4楼2014-06-29 07:21:44
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2014-07-15 15:56:53
引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-06-29 00:33:24
50ul体系,酶只加0.25ul?会不会太少了?我最近也在构28a的载体,切的也比较奇怪,切完后比空载跑的还快,不知道怎么回事

正常质粒是闭合的双链DNA。在电泳过程中可能使质粒发生开环,或者由开环解开螺旋变成线形。这三种形态电泳时的分离率不同,分离速度不同,分成三带。闭环(超螺旋),开环,线形的螺旋率依次降低。(开环质粒是指双链环状的质粒DNA有部分解链,因此电泳速度最慢)三种构像的质粒在琼脂糖电泳的前后顺序是搜索超螺旋>线形>开环,线形的质粒在中间,而开环的质粒在最后。判断质粒质粒好坏的一个指标就是超螺旋质粒在所以质粒中的含量。
5楼2014-07-01 15:19:07
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

引用回帖:
3楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2014-06-29 00:33:24
50ul体系,酶只加0.25ul?会不会太少了?我最近也在构28a的载体,切的也比较奇怪,切完后比空载跑的还快,不知道怎么回事

pET28a质粒提取出来之后,双酶切之后正常是不是有两条带?是不是要保证检测之后正确才能与目的基因进行连接?谢谢!
喜欢生物,所以想好好研究下去!
6楼2015-01-15 10:31:26
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你可以做个对照,酶加1ul,分别做单酶切、双酶切、对照、看看什么情况吧。
7楼2015-01-15 13:40:45
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