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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒不表达
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笔笔小结

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒不表达 已有3人参与

表达载体是pET28a，在-20冰箱放了两年，拿出来做表达，SDS-PAGE没有目的条带出来。两年前表达量挺高的，这是什么原因呢，按理说质粒放-20两年应该没问题的
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1楼 2016-03-22 15:02:33
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永恒_99

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-03-24 07:32:22
连接目的基因的载体需要保存在DH5a中，需要提出质粒重新转化进BL21中。
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2楼2016-03-22 16:18:17
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笔笔小结

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 永恒_99 at 2016-03-22 16:18:17
连接目的基因的载体需要保存在DH5a中，需要提出质粒重新转化进BL21中。

DH5a感受态细胞不是用于质粒扩增的吗？你的意思是重组质粒先转化DH5a，提质粒后再转化BL21DE3中？可是这样做的原因是？请指教
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3楼2016-03-23 20:42:59
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haijun海军11

新虫 (小有名气)
可能是中间某步操作有问题吧，一般这种问题再重复一次试试，载体-20应该不会有问题

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大家一起加油
4楼2016-03-24 00:04:31
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
将两年前的质粒重新转化DH5a提一次，然后转化BL21再行诱导表达
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2016-03-24 01:59:41
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你提出质粒，做过PCR，看看条等，在吧这个质粒重组到BL21(DE3).
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2016-03-24 14:19:17
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笔笔小结

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2016-03-24 01:59:41
将两年前的质粒重新转化DH5a提一次，然后转化BL21再行诱导表达

谢谢
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7楼2016-03-28 20:17:25
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RCEESTHZ

铁虫 (初入文坛)
老师您好，我的质粒是puc19-EGFP，我发现转后的大肠杆菌在固体培养基中传几代后，EGFP就不表达了，非得等稳定期又开始表达了
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8楼2024-07-10 13:29:08
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