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两种重组质粒的重新构建问题
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有两个质粒：pEGFP-N3质粒和PET-28a质粒，想从pEGFP-N3质粒中获得EGFP基因并 将其导入到PET-28a质粒中重新构建表达载体——PET-28a-EGFP并表达绿色荧光蛋白，有文献以EGFP基因为模板设计引物经PCR扩增获得目的基因，并将经纯化的目的基因为模板，再设计引物引入酶切位点进行扩增得到引入酶切位点的目的基因；另外将PET-28a质粒载体转化大肠埃希菌DH5α，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切．经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。 我想问的是：为什么要将PET-28a质粒载体转化DH5α后再重新提取质粒，而不是直接将PET-28a质粒进行双酶切？是怕质粒的量不够吗？还是有其他原因？另外，假如我想直接通过双酶切从pEGFP-N3质粒中获得整段的EGFP基因，再用相同的双酶切体系对PET-28a质粒进行酶切，最后再将其重新连接起来获得新的重组质粒，在网上看到卖的质粒规格一般是2ug，是否够用呢？是否需要分别将pEGFP-N3质粒和PET-28a质粒分别转化DH5α后再分别重新提取质粒？还是可以直接将这两种质粒进行酶切？ 由于没有做过分子生物方面的实验，有很多不懂的地方，麻烦高手帮帮忙，谢谢大家了！ |
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2楼2013-04-20 05:34:03