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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 要表达蛋白，构建重组质粒，好几次不成功
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向日21

新虫 (小有名气)

[求助] 要表达蛋白，构建重组质粒，好几次不成功 已有7人参与

要表达蛋白，构建重组质粒，我设计的酶切引物上只有酶切位点6个碱基，无论如何都连不上，是因为与质粒的同源壁太短么？我的片段长两千五百bp。我该怎么设计引物，同源壁要多长？

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1楼 2015-12-06 10:18:35
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xl0071334

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
向日21(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-05 19:25:30
楼主的引物没有保护碱基，所以PCR产物没有切开，如果不换引物的话，建议先连T载体

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5楼2016-01-05 07:09:49
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 刘氏响声丸 at 2016-01-05 09:00:52
可能像楼上说的引物设计有点问题
再者就是酶切没有切完全，质粒酶切没有完全
还有就是运气和经验了，，
祝好运

保护碱基必须加的吗
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
8楼2016-01-05 09:31:06
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qinqqjiajia

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
向日21(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-05 19:25:53
可以先连到T载体上然后再转到目的载体上，另外加上保护碱基
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9楼2016-01-05 10:46:18
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普通回帖

绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
向日21(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-01-05 19:25:04
你的片段不长，应该问题不大，可能原因有几个：第一，酶切位点前一般需要设置保护碱基，第二，你做酶切反应时，没有切开，第三，连接效率不高，第四，你的切好的载体有问题，第五，酶切时时间太长，片段切碎了。供参考

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2楼2015-12-06 10:22:19
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向日21

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绿枫隽 at 2015-12-06 10:22:19
你的片段不长，应该问题不大，可能原因有几个：第一，酶切位点前一般需要设置保护碱基，第二，你做酶切反应时，没有切开，第三，连接效率不高，第四，你的切好的载体有问题，第五，酶切时时间太长，片段切碎了。供参 ...

我还想再问一下，质粒的浓度要达到多少连接效率会好一点，我之前做的只有10ng/ul

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3楼2015-12-06 10:39:46
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-01-05 19:25:20
我也是，切好了载体和片段，连了两次都连不上，不知道问题出在哪里
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
4楼2016-01-04 22:41:51
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chun.shui

金虫 (正式写手)
加油

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6楼2016-01-05 07:10:19
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刘氏响声丸

铁虫 (小有名气)
★
向日21(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-05 19:26:02
可能像楼上说的引物设计有点问题
再者就是酶切没有切完全，质粒酶切没有完全
还有就是运气和经验了，，
祝好运

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2016-01-05 09:00:52
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刘氏响声丸

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-01-05 09:31:06
保护碱基必须加的吗...

加了保护碱基对切割效率有帮助吧，你可以搜一下各酶切保护碱基的长度和酶切效率

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2016-01-05 16:52:00
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