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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 要表达蛋白，构建重组质粒，好几次不成功
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 刘氏响声丸 at 2016-01-05 16:52:00
加了保护碱基对切割效率有帮助吧，你可以搜一下各酶切保护碱基的长度和酶切效率
...

片段跟载体连不上会不会跟酶切时间有关，我加的酶切位点切出来后有平头末端也有粘性末端，我之前只连3-4个小时，这回过夜试试，转化了涂板子还没长出来
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
11楼2016-01-06 11:26:14
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刘氏响声丸

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-01-06 11:26:14
片段跟载体连不上会不会跟酶切时间有关，我加的酶切位点切出来后有平头末端也有粘性末端，我之前只连3-4个小时，这回过夜试试，转化了涂板子还没长出来...

酶切不完全的话肯定导致连接的效率降低

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2016-01-06 12:48:35
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

建议你先把你的pcr片段先连T载体，等T载体的质粒多了在酶切质粒做全长，引物设计的也有点问题，引物前面要和目的序列有至少15个碱基的结合，再加酶切位点再加保护碱基等
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13楼2016-01-06 16:05:03
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向日21

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by a13515517892 at 2016-01-06 16:05:03
建议你先把你的pcr片段先连T载体，等T载体的质粒多了在酶切质粒做全长，引物设计的也有点问题，引物前面要和目的序列有至少15个碱基的结合，再加酶切位点再加保护碱基等

我按照网上的酶切位点保护碱基表加的保护碱基，应该没有问题了啊？还是除了保护碱基还需要与我链接的质粒有同源壁？

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14楼2016-01-07 09:13:25
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向日21

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by a13515517892 at 2016-01-06 16:05:03
建议你先把你的pcr片段先连T载体，等T载体的质粒多了在酶切质粒做全长，引物设计的也有点问题，引物前面要和目的序列有至少15个碱基的结合，再加酶切位点再加保护碱基等

最近一直在连T载体，可是怎么都连不上啊，转化后什么都不长

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15楼2016-01-07 09:14:00
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 向日21 at 2016-01-07 09:14:00
最近一直在连T载体，可是怎么都连不上啊，转化后什么都不长
...

看看你的产物和载体是不是处理好了，同时最好请你的师兄师姐帮忙分析一下问题出在哪里，或者请其他朋友帮你做一下看看。
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16楼2016-01-07 11:19:22
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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 向日21 at 2016-01-07 09:13:25
我按照网上的酶切位点保护碱基表加的保护碱基，应该没有问题了啊？还是除了保护碱基还需要与我链接的质粒有同源壁？
...

你是做的酶切pcr产物再连接的还是直接扩增了之后连接T载体的
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17楼2016-01-07 11:20:56
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诸葛小汐

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

试下hot fusion 这个方法  比酶切酶连要好得多。。。
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18楼2016-01-07 18:59:48
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看楼主提到同源臂，你是用重组酶的方法链接吗？重组链接互补序列一般要15bp以上呢。
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生物科学
19楼2016-01-07 20:15:06
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15110796018

新虫 (初入文坛)
掌握好克隆片段和载体的摩尔质量比！这个非常关键！

发自小木虫Android客户端
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20楼2016-01-08 12:01:21
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