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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 要表达蛋白，构建重组质粒，好几次不成功
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向日21

新虫 (小有名气)

[求助] 要表达蛋白，构建重组质粒，好几次不成功 已有7人参与

要表达蛋白，构建重组质粒，我设计的酶切引物上只有酶切位点6个碱基，无论如何都连不上，是因为与质粒的同源壁太短么？我的片段长两千五百bp。我该怎么设计引物，同源壁要多长？

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1楼 2015-12-06 10:18:35
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向日21

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by a13515517892 at 2016-01-06 16:05:03
建议你先把你的pcr片段先连T载体，等T载体的质粒多了在酶切质粒做全长，引物设计的也有点问题，引物前面要和目的序列有至少15个碱基的结合，再加酶切位点再加保护碱基等

最近一直在连T载体，可是怎么都连不上啊，转化后什么都不长

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15楼2016-01-07 09:14:00
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绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
向日21(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-01-05 19:25:04
你的片段不长，应该问题不大，可能原因有几个：第一，酶切位点前一般需要设置保护碱基，第二，你做酶切反应时，没有切开，第三，连接效率不高，第四，你的切好的载体有问题，第五，酶切时时间太长，片段切碎了。供参考

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2楼2015-12-06 10:22:19
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向日21

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绿枫隽 at 2015-12-06 10:22:19
你的片段不长，应该问题不大，可能原因有几个：第一，酶切位点前一般需要设置保护碱基，第二，你做酶切反应时，没有切开，第三，连接效率不高，第四，你的切好的载体有问题，第五，酶切时时间太长，片段切碎了。供参 ...

我还想再问一下，质粒的浓度要达到多少连接效率会好一点，我之前做的只有10ng/ul

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3楼2015-12-06 10:39:46
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-01-05 19:25:20
我也是，切好了载体和片段，连了两次都连不上，不知道问题出在哪里
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
4楼2016-01-04 22:41:51
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