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向日21

新虫 (小有名气)

[求助] 要表达蛋白,构建重组质粒,好几次不成功 已有7人参与

要表达蛋白,构建重组质粒,我设计的酶切引物上只有酶切位点6个碱基,无论如何都连不上,是因为与质粒的同源壁太短么?我的片段长两千五百bp。我该怎么设计引物,同源壁要多长?

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a13515517892

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 向日21 at 2016-01-07 09:13:25
我按照网上的酶切位点保护碱基表加的保护碱基,应该没有问题了啊?还是除了保护碱基还需要与我链接的质粒有同源壁?
...

你是做的酶切pcr产物再连接的还是直接扩增了之后连接T载体的
17楼2016-01-07 11:20:56
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绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
向日21(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-01-05 19:25:04
你的片段不长,应该问题不大,可能原因有几个:第一,酶切位点前一般需要设置保护碱基,第二,你做酶切反应时,没有切开,第三,连接效率不高,第四,你的切好的载体有问题,第五,酶切时时间太长,片段切碎了。供参考

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2楼2015-12-06 10:22:19
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向日21

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 绿枫隽 at 2015-12-06 10:22:19
你的片段不长,应该问题不大,可能原因有几个:第一,酶切位点前一般需要设置保护碱基,第二,你做酶切反应时,没有切开,第三,连接效率不高,第四,你的切好的载体有问题,第五,酶切时时间太长,片段切碎了。供参 ...

我还想再问一下,质粒的浓度要达到多少连接效率会好一点,我之前做的只有10ng/ul

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3楼2015-12-06 10:39:46
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-01-05 19:25:20
我也是,切好了载体和片段,连了两次都连不上,不知道问题出在哪里
想做个有趣的人,却在逗比的道路上越走越远~
4楼2016-01-04 22:41:51
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