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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 要表达蛋白，构建重组质粒，好几次不成功
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向日21

新虫 (小有名气)

[求助] 要表达蛋白，构建重组质粒，好几次不成功 已有7人参与

要表达蛋白，构建重组质粒，我设计的酶切引物上只有酶切位点6个碱基，无论如何都连不上，是因为与质粒的同源壁太短么？我的片段长两千五百bp。我该怎么设计引物，同源壁要多长？

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1楼 2015-12-06 10:18:35
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 刘氏响声丸 at 2016-01-05 16:52:00
加了保护碱基对切割效率有帮助吧，你可以搜一下各酶切保护碱基的长度和酶切效率
...

片段跟载体连不上会不会跟酶切时间有关，我加的酶切位点切出来后有平头末端也有粘性末端，我之前只连3-4个小时，这回过夜试试，转化了涂板子还没长出来
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
11楼2016-01-06 11:26:14
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绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
向日21(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-01-05 19:25:04
你的片段不长，应该问题不大，可能原因有几个：第一，酶切位点前一般需要设置保护碱基，第二，你做酶切反应时，没有切开，第三，连接效率不高，第四，你的切好的载体有问题，第五，酶切时时间太长，片段切碎了。供参考

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2楼2015-12-06 10:22:19
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向日21

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绿枫隽 at 2015-12-06 10:22:19
你的片段不长，应该问题不大，可能原因有几个：第一，酶切位点前一般需要设置保护碱基，第二，你做酶切反应时，没有切开，第三，连接效率不高，第四，你的切好的载体有问题，第五，酶切时时间太长，片段切碎了。供参 ...

我还想再问一下，质粒的浓度要达到多少连接效率会好一点，我之前做的只有10ng/ul

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3楼2015-12-06 10:39:46
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-01-05 19:25:20
我也是，切好了载体和片段，连了两次都连不上，不知道问题出在哪里
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
4楼2016-01-04 22:41:51
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