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向日21

新虫 (小有名气)

[求助] 要表达蛋白,构建重组质粒,好几次不成功 已有7人参与

要表达蛋白,构建重组质粒,我设计的酶切引物上只有酶切位点6个碱基,无论如何都连不上,是因为与质粒的同源壁太短么?我的片段长两千五百bp。我该怎么设计引物,同源壁要多长?

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刘氏响声丸

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-01-06 11:26:14
片段跟载体连不上会不会跟酶切时间有关,我加的酶切位点切出来后有平头末端也有粘性末端,我之前只连3-4个小时,这回过夜试试,转化了涂板子还没长出来...

酶切不完全的话肯定导致连接的效率降低

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
12楼2016-01-06 12:48:35
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查看全部 20 个回答

绿枫隽

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
向日21(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-01-05 19:25:04
你的片段不长,应该问题不大,可能原因有几个:第一,酶切位点前一般需要设置保护碱基,第二,你做酶切反应时,没有切开,第三,连接效率不高,第四,你的切好的载体有问题,第五,酶切时时间太长,片段切碎了。供参考

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2楼2015-12-06 10:22:19
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向日21

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 绿枫隽 at 2015-12-06 10:22:19
你的片段不长,应该问题不大,可能原因有几个:第一,酶切位点前一般需要设置保护碱基,第二,你做酶切反应时,没有切开,第三,连接效率不高,第四,你的切好的载体有问题,第五,酶切时时间太长,片段切碎了。供参 ...

我还想再问一下,质粒的浓度要达到多少连接效率会好一点,我之前做的只有10ng/ul

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3楼2015-12-06 10:39:46
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2016-01-05 19:25:20
我也是,切好了载体和片段,连了两次都连不上,不知道问题出在哪里
想做个有趣的人,却在逗比的道路上越走越远~
4楼2016-01-04 22:41:51
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