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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于真核生物表达系统的一些问题
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wuwenmei

新虫 (小有名气)

[求助] 关于真核生物表达系统的一些问题 已有2人参与

我要表达的目的序列大概200多个bp.是一个富含二硫键的蛋白质，以前有人对这个蛋白做过这个研究，是在原核生物表达系统中利用SUMO构建重组蛋白，但是是包涵体，要蛋白质复性，蛋白质复性就面对着失活，那我应该怎么做？可以放进真核生物表达系统中做吗？老板让我找一个分泌性表达载体做，他希望不需要超声破碎，可以分泌到培养基中，或者上清中，我应该怎么下手？我怎么感觉这就是一个坑，哎，谁能帮我解答下呀，最后，想问下哪一个真核生物表达系统适合做我的表达系统，我怎么选择哪一个？有做过真核生物表达系统的大牛吗？希望能解答下，谢谢，
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下雨天就算没有伞，我也要学会努力奔跑！
1楼 2015-03-26 22:25:08
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kehope

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-03-28 16:24:45
是个坑。我也解答不了你这个问题。
我们实验室也是有个蛋白，原核表达不成功后老板让我进行真核表达。但是因为实验室穷，不可能做瞬时转染。所以筛选稳定株。但是稳定株做出来后蛋白表达量很低，过柱子纯化不下来。
所以我现在又掉头做原核表达，我找了一些其他载体。除了sumo,nus,gst的我都进行尝试。现在质粒已经成功，开始要小量表达纯化，想到过柱子，切标签过柱子之后蛋白还不知道有没有活性我就犯愁啊。

我们学院新来了一个老师，做起真核表达可是刷刷的。不禁感慨隔行如隔山，有没有人带着差别可真大。


真核表达就是比较费钱。只要舍得花钱。
转染试剂一转染个五六十皿，细胞裂解液还带走蛋白酶体抑制剂的一保护，买最贵的纯化柱子一纯化，就爽了。

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2楼2015-03-26 23:28:47
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wuwenmei

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kehope at 2015-03-26 23:28:47
是个坑。我也解答不了你这个问题。
我们实验室也是有个蛋白，原核表达不成功后老板让我进行真核表达。但是因为实验室穷，不可能做瞬时转染。所以筛选稳定株。但是稳定株做出来后蛋白表达量很低，过柱子纯化不下来。 ...

原来真核生物表达系统做起来很费钱对吧！我种算弄懂了，那我现在改咋办？？原核生物表达系统筛选一个好的分泌性表达载体？？？我真的愁死了。。还是没开好头，不会做到一般有重新开头做吧！哎，

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3楼2015-03-26 23:42:04
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kehope

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wuwenmei at 2015-03-26 23:42:04
原来真核生物表达系统做起来很费钱对吧！我种算弄懂了，那我现在改咋办？？原核生物表达系统筛选一个好的分泌性表达载体？？？我真的愁死了。。还是没开好头，不会做到一般有重新开头做吧！哎，
...

接下来不管你做原核表达还是真核表达都建议你有b计划。
这次我做回原核表达就选了四个不同载体，最后有两个表达情况比较好，所以进行下一个步骤。

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4楼2015-03-27 01:12:19
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wuwenmei

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kehope at 2015-03-27 01:12:19
接下来不管你做原核表达还是真核表达都建议你有b计划。
这次我做回原核表达就选了四个不同载体，最后有两个表达情况比较好，所以进行下一个步骤。
...

你好，我还是决定现在原核生物中做吧，我选择pET-3C和pET-28a两个载体，共同酶切位点选择NdeI和BamH-I。你觉得行不行呀，用SUMO标签。我刚刚我师姐说要考虑HIs-tag,什么意思呀。。求指教、
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5楼2015-03-27 14:48:28
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kehope

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wuwenmei at 2015-03-27 14:48:28
你好，我还是决定现在原核生物中做吧，我选择pET-3C和pET-28a两个载体，共同酶切位点选择NdeI和BamH-I。你觉得行不行呀，用SUMO标签。我刚刚我师姐说要考虑HIs-tag,什么意思呀。。求指教、...

his taq是一个标签。
蛋白表达后，细菌表达就一堆蛋白。目的蛋白怎么可以跟其他蛋白分离？可以带上标签然后过柱子。比如你的目的蛋白接着his标签，在镍柱上有特别的吸附能力。就跟其他蛋白的吸附能力不一样，通过镍柱就可以分离开来。

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6楼2015-03-27 15:23:12
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wuwenmei

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kehope at 2015-03-27 15:23:12
his taq是一个标签。
蛋白表达后，细菌表达就一堆蛋白。目的蛋白怎么可以跟其他蛋白分离？可以带上标签然后过柱子。比如你的目的蛋白接着his标签，在镍柱上有特别的吸附能力。就跟其他蛋白的吸附能力不一样，通过 ...

懂了，我们建的SUMO标签本身就包含的HIS-tag,对吧？要是用28a在SUMO的前面还有一个His,没有影响吧，我的意思是载体上带了his-TAG,没影响吧，
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7楼2015-03-27 21:03:57
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
pet系列表达也很难是分泌型的。你可以看看酵母表达。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
8楼2015-03-28 00:18:57
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zergbloody

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酵母表达系统和枯草表达系统应该都可以达到要求的 可以了解一下

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9楼2015-03-28 10:10:17
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wuwenmei

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-28 00:18:57
pet系列表达也很难是分泌型的。你可以看看酵母表达。

老板说以前也做过酵母表达，可是一到扩大摇瓶培养，然后就检测不到活性了，所以希望我是原核生物表达系统试试。有没有大牛知道共表达分子伴侣吗？我的一个想法是构建一个SUMO重组蛋白，在导入有伴侣蛋白质粒Escerichia coli BL21制成的感受态细胞。促进可溶性蛋白的表达，这个想法能不能行？主要我们实验室现在还没有接触这一块，所以我不是很懂。虽然SUMO有分子伴侣功能，我要是在加入伴侣蛋白质粒效果会不会更好点，主要我的目的序列是富含二硫健的蛋白，在原核生物系统中容易形成包涵体，所以想通过其他手段能不能改变这个现状呢？
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10楼2015-03-30 21:13:10
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