连接转化的时候，去磷酸化吧什么都不长，不去磷酸化吧长不少全自连
连接转化的时候，质粒酶切后，去磷酸化吧什么都不长，不去磷酸化吧长不少全自连。
做了3多个月了，都是这个结果。所有试剂材料都排除过，没有问题。
请问大侠们有没有好建议啊！！！！
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不一定非要单酶切吧
为何不考虑双妹切连接
和老板提过了，她就说她做了那么多年吧啦吧啦的，超无奈
，
说明你酶切有问题啊，去磷酸后不自连，不去磷酸化自连，说明你没有切完全，就是有单酶切在里边，另一个酶没切开，你是那两个酶，如果共用Buffer有个效率低的，我建议你先单酶切他，然后回收后在切另一个酶，根本不需要去磷酸化，转化没问题，前提要保证片段也酶切好了。
要不先不加酶将载体与片段50度孵育20分钟，冷却下来后加酶连接