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与PMD-19T连接问题

作者 小冀-: 来源: 小木虫 1100 22 举报帖子

用PMD-19T载体与我的目的基因片段（3.3kb）链接，之前用高保真酶进行PCR扩增后通过加A试剂盒进行加A尾，之后热击转化，涂布后长出菌落，但是提质粒鉴定后发现载体自连（单双酶切条带一样，只有一条，有一个不一样的，但单切有出现两条条带）；后来用一步克隆试剂盒进行连接，但涂布后没有菌落，一直不知道是什么原因，请高人指教··· 返回小木虫查看更多

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精华评论

古月木木

引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 17:59:44
连接效率上去了，不做蓝白斑也行，我都是直接上氨苄板筛的
...

可以降低假阳性的概率，lucky to you
Neo2000
小冀-

引用回帖:
6楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 14:27:25
那个载体自连率是很高的，它不是都带有t的突出末端的。我都不买他们家的载体用，命中率不好
...

你是说可能是载体的问题吗
，
小冀-

引用回帖:
8楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 17:59:44
连接效率上去了，不做蓝白斑也行，我都是直接上氨苄板筛的
...

我也是氨苄平板筛的···
古月木木

引用回帖:
10楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-18 09:33:20
我这边的阳性率已经接近100%，你觉得还有必要蓝白斑吗？
...

ok
忘记将来

19T 自连很正常，他质量没那么好，建议4℃ 过夜，增加连接效率
Neo2000
Neo2000