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与PMD-19T连接问题

作者 小冀-: 来源: 小木虫 1100 22 举报帖子

用PMD-19T载体与我的目的基因片段（3.3kb）链接，之前用高保真酶进行PCR扩增后通过加A试剂盒进行加A尾，之后热击转化，涂布后长出菌落，但是提质粒鉴定后发现载体自连（单双酶切条带一样，只有一条，有一个不一样的，但单切有出现两条条带）；后来用一步克隆试剂盒进行连接，但涂布后没有菌落，一直不知道是什么原因，请高人指教··· 返回小木虫查看更多

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精华评论

Neo2000

平末端的再加A进行ta克隆，效率本来就很低，你可以考虑用taq，循环数低一点，多扩一点，回收时少加点水浓缩，连接时不加水多加PCR产物，试试，祝好
小冀-

引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 09:40:07
平末端的再加A进行ta克隆，效率本来就很低，你可以考虑用taq，循环数低一点，多扩一点，回收时少加点水浓缩，连接时不加水多加PCR产物，试试，祝好

我用Ex-Taq酶做过一次，片段是P出来了，而且都说用它P的都会存在A尾，所以就直接连了，鉴定时还是没有连上···
，
小冀-

引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-06-17 12:11:58
那说明问题出在ta克隆这一步，18t是很一般的t载体，建议用pGEM T Easy，NEB的连接酶
...

我也感觉是在这一步，但是又没法解释最后鉴定的时候载体居然都是自连的···
古月木木

建议做蓝白筛选，换ligase，直观提高连接效率