引用回帖:

Originally posted by 王营wy at 2011-07-08 13:12:29:
我的两个条带是切胶前后跑DGGE都有，而且两个条带距离挺大，应该不是没分开的情况，好像是在PCR扩增中跟我要的条带一起扩增出现的。你说的连T载体测序是还要转到大肠杆菌感受态中，涂板筛选阳性克隆，再PCR测序 ...

你的意思是说你切胶切了两条带,但是pcr扩增后再次DGGE的时候每个泳道内都有这两条带是吗?
如果是这种情况,那很可能是你切胶的时候造成了交叉污染.最好是把大致的图放上来让大家看看

是的,pcr后最好纯化一下,然后连接T载体,然后转入大肠杆菌感受态中,涂板(含有抗生素,一般为amp),蓝白斑筛选阳性克隆或是直接菌体裂解检测质粒大小来确定是否是阳性克隆.然后将阳性克隆在含有相应抗生素的液体培养基中震荡培养,然后直接送菌液测序
，

噢,对了,切胶PCR后重新DGGE时,两个样品中间相隔几个泳道.也有可能是相互扩散了

要把刀子洗干净 另外 多选克隆子去测序 再把得到的克隆子跑个DGGE 你又意想不到的结果

你好，我想请教一下DGGE的胶回收怎样做呀？万分感谢
祝实验顺利

谢谢wubingqi 的建议，我会试试看，非常感谢！

引用回帖:

Originally posted by lanhuaorchid at 2011-07-12 21:44:28:
你好，我想请教一下DGGE的胶回收怎样做呀？万分感谢
祝实验顺利

我胶回收是按下面步骤做的：切下的DNA条带放入EP管中，加入0.5ml的去离子水清洗，离心，去上清，此冲洗步骤重复2－3次，加入50μLddH2O，4°C 过夜保存。2000rpm离心5min，取10μL上清作为PCR模板。

引用回帖:

Originally posted by 王营wy at 2011-07-12 21:53:12:
我胶回收是按下面步骤做的：切下的DNA条带放入EP管中，加入0.5ml的去离子水清洗，离心，去上清，此冲洗步骤重复2－3次，加入50μLddH2O，4°C 过夜保存。2000rpm离心5min，取10μL上清作为PCR模板。

非常感谢哈，我也按照步骤做一下，等待好的结果

我怎么觉得是引物的问题呢 楼主两次PCR的引物是一样的吗？