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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助DGGE割胶回收测序问题
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王营wy

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助DGGE割胶回收测序问题

DGGE跑完后进行银染，然后割胶回收两个主要条带（两者有一定距离不会割胶后在一起），各自进行PCR扩增，再进行DGGE电泳比对两条带是否与之前回收的条带一致。结果PCR后所得的条带及亮度均达到满意效果，但再次DGGE进行验证条带时发现每一个回收的条带均含有与之前回收的两个条带一致的两条条带，在这种情况下不知道能否送去测序？帮帮我吧，非常着急，非常感谢！！！
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阳光总在风雨后
1楼2011-06-30 18:06:47
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

★
zhang8826857(金币+1): 鼓励就 2011-12-14 23:30:22
直接送样测序可能会得到“套局部峰”的结果。

我觉得可以连T载体，多送几个克隆去测序。
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王营wy
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-06-30 22:54:19
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王营wy

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-06-30 22:54:19:
直接送样测序可能会得到“套局部峰”的结果。

我觉得可以连T载体，多送几个克隆去测序。

非常感谢你的帮助，我感觉每次割胶回收条带PCR扩增后琼脂糖电泳结果很好，但DGGE都会出现两个条带，好像两个条带是PCR扩增同时产生的，不知道该如何处理了
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阳光总在风雨后
3楼2011-07-01 10:26:00
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-07-13 16:08:42
就像我说的，连T载体多送几个测序，可能是序列上有很小的差别，agrose gel 之分辨大小，而DGGE在理论上可以分辨几个碱基的差异。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
4楼2011-07-01 12:27:44
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王营wy

新虫 (初入文坛)
谢谢brightfuture01的帮助，非常感谢！！！
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阳光总在风雨后
5楼2011-07-05 17:50:32
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yuheng19831123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
王营wy(金币+1): 谢谢~~ 2011-07-09 13:40:18
zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2011-12-14 23:31:04
同学 dgge胶中的基因没有你想象的那么纯，pcr过后会有多条带出现
在dgge中有人用pcr测序测准了我是不会相信的
一般必需连上T载体才能保证没有套峰出现
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6楼2011-07-05 19:29:11
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

王营wy(金币+1): 谢谢~~ 2011-07-09 13:40:03
是的，必须要连接载体进行测序，否者会出现双峰的情况。
切胶后扩增pcr重新跑dgge出现两条带，说明在第一次DGGE时没有完全分开。DGGE就是这样，看着是一条带实际上可能会有好几条。
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7楼2011-07-06 10:53:47
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王营wy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wubingqi at 2011-07-06 10:53:47:
是的，必须要连接载体进行测序，否者会出现双峰的情况。
切胶后扩增pcr重新跑dgge出现两条带，说明在第一次DGGE时没有完全分开。DGGE就是这样，看着是一条带实际上可能会有好几条。

我的两个条带是切胶前后跑DGGE都有，而且两个条带距离挺大，应该不是没分开的情况，好像是在PCR扩增中跟我要的条带一起扩增出现的。你说的连T载体测序是还要转到大肠杆菌感受态中，涂板筛选阳性克隆，再PCR测序，是这么个过程吗？
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阳光总在风雨后
8楼2011-07-08 13:12:29
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wubingqi

木虫 (小有名气)
★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-07-13 16:08:57
引用回帖:
Originally posted by 王营wy at 2011-07-08 13:12:29:
我的两个条带是切胶前后跑DGGE都有，而且两个条带距离挺大，应该不是没分开的情况，好像是在PCR扩增中跟我要的条带一起扩增出现的。你说的连T载体测序是还要转到大肠杆菌感受态中，涂板筛选阳性克隆，再PCR测序 ...

你的意思是说你切胶切了两条带,但是pcr扩增后再次DGGE的时候每个泳道内都有这两条带是吗?
如果是这种情况,那很可能是你切胶的时候造成了交叉污染.最好是把大致的图放上来让大家看看

是的,pcr后最好纯化一下,然后连接T载体,然后转入大肠杆菌感受态中,涂板(含有抗生素,一般为amp),蓝白斑筛选阳性克隆或是直接菌体裂解检测质粒大小来确定是否是阳性克隆.然后将阳性克隆在含有相应抗生素的液体培养基中震荡培养,然后直接送菌液测序.
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9楼2011-07-10 09:13:32
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wubingqi

木虫 (小有名气)
噢,对了,切胶PCR后重新DGGE时,两个样品中间相隔几个泳道.也有可能是相互扩散了
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10楼2011-07-10 17:56:50
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