求助DGGE割胶回收测序问题
DGGE跑完后进行银染,然后割胶回收两个主要条带(两者有一定距离不会割胶后在一起),各自进行PCR扩增,再进行DGGE电泳比对两条带是否与之前回收的条带一致。结果PCR后所得的条带及亮度均达到满意效果,但再次DGGE进行验证条带时发现每一个回收的条带均含有与之前回收的两个条带一致的两条条带,在这种情况下不知道能否送去测序?帮帮我吧,非常着急,非常感谢!!! 返回小木虫查看更多
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DGGE跑完后进行银染,然后割胶回收两个主要条带(两者有一定距离不会割胶后在一起),各自进行PCR扩增,再进行DGGE电泳比对两条带是否与之前回收的条带一致。结果PCR后所得的条带及亮度均达到满意效果,但再次DGGE进行验证条带时发现每一个回收的条带均含有与之前回收的两个条带一致的两条条带,在这种情况下不知道能否送去测序?帮帮我吧,非常着急,非常感谢!!! 返回小木虫查看更多
直接送样测序可能会得到“套局部峰”的结果。
我觉得可以连T载体,多送几个克隆去测序。
非常感谢你的帮助,我感觉每次割胶回收条带PCR扩增后琼脂糖电泳结果很好,但DGGE都会出现两个条带,好像两个条带是PCR扩增同时产生的,不知道该如何处理了
就像我说的,连T载体多送几个测序,可能是序列上有很小的差别,agrose gel 之分辨大小,而DGGE在理论上可以分辨几个碱基的差异。
谢谢brightfuture01的帮助,非常感谢!!!
同学 dgge胶中的基因没有你想象的那么纯,pcr过后会有多条带出现
在dgge中有人用pcr测序测准了我是不会相信的
一般必需连上T载体才能保证没有套峰出现
是的,必须要连接载体进行测序,否者会出现双峰的情况。
切胶后扩增pcr重新跑dgge出现两条带,说明在第一次DGGE时没有完全分开。DGGE就是这样,看着是一条带实际上可能会有好几条。
我的两个条带是切胶前后跑DGGE都有,而且两个条带距离挺大,应该不是没分开的情况,好像是在PCR扩增中跟我要的条带一起扩增出现的。你说的连T载体测序是还要转到大肠杆菌感受态中,涂板筛选阳性克隆,再PCR测序,是这么个过程吗
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