【求助】IPTG诱导大肠杆菌表达的用量,温度,转速等条件是怎样的?
本人是新手,刚开始实验没多久,最近要做IPTG诱导大肠杆菌表达的实验,载体是PET28a,宿主是BL21。不知道要如何配置IPTG试剂?诱导时用量是多少?培养温度、转速多少合适?有什么需要注意的地方?请高手指教,多谢!
返回小木虫查看更多
今日热帖
本人是新手,刚开始实验没多久,最近要做IPTG诱导大肠杆菌表达的实验,载体是PET28a,宿主是BL21。不知道要如何配置IPTG试剂?诱导时用量是多少?培养温度、转速多少合适?有什么需要注意的地方?请高手指教,多谢!
返回小木虫查看更多
建议你先分析一下你的蛋白质的性质,比如是否含有大肠杆菌的稀有密码子,大小,疏水性(膜蛋白),是否对细胞具有毒性
如果这些都没有问题的话,那么就容易了,基本大肠杆菌的生长条件;新鲜菌株接种后在OD600=0.3左右加入IPTG到终浓度为1mM,37°,180-200rpm三小时后收集即可
建议在加IPTG前和蛋白收集前取1mL菌液,离心收集细胞,裂解后走SDS-PAGE看看是否有你的蛋白被诱导出来.(严格的说你需要同时诱导空载体的菌株)
如果你不放心,可以在培养基中加点儿葡萄糖防止渗漏表达,
IPTG一般配制成100mM的储存液,我们做表达用BL21做宿主菌,加三个IPTG的浓度,分别是0.1mM,0.5mM,1mM,然后看哪个浓度最合适就采用哪个浓度。37度,200rpm 4h或者30度过夜诱导,具体看你的蛋白的合成速度及你想要的表达方式。
30°诱导是不是得时间长些好呢?我以前是4个小时。但是现在蛋白表达不出来,很郁闷------