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义翘神州

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[资源] 免疫组化IHC结果太漂亮也可能是假的？6组对照设对了才能让审稿人满意！

免疫组化（ihc）作为一种精准的免疫检测技术，利用抗原-抗体特异性结合机制，将组织或细胞内的特定蛋白“可视化”——定位、定性，一气呵成。通过对ihc样本制备和染色过程的精细优化，我们获得强烈而特异的信号。一张精美的ihc片子，清晰展示靶蛋白在正确组织、正确亚细胞的分布。
但是，问题来了：我们如何确定这张精美的片子不是一场“美丽的邂逅”呢？
答案就是：设置对照。
ihc实验需要通过6种精心设计的对照，来帮助我们判断观察到的染色结果是否准确有效，并识别可能出现的假象。缺乏对照的实验，即使染色信号再漂亮，也无法摆脱背景噪音的干扰，论证不严谨，失去科学价值。

「ihc诊断室」第10期，为大家介绍ihc实验中常用的6种对照。

一、对照：ihc结果判读的“标尺”
在免疫组化实验中，对照扮演着“参照物”的关键角色。它告诉你试剂是否有效、染色系统是否正常运转、操作流程是否规范。最终回答一个关键问题：检测到的信号是真阳性还是假阳性？
对照设置的三大核心原则：

通俗来说：选择一类已知高表达靶蛋白的组织作为阳性对照，再选一类已知不表达的组织作为阴性对照，再设计一款不加一抗的空白对照，与实验样本同步处理。如果对照达到预期结果，你就可以“昂首挺胸”的认定实验结果可靠，反之则需要根据对照的结果，对操作步骤和试剂进行优化调整。

二、6类ihc对照详解：从入门到精通
2.1阳性对照
目的：验证整个ihc操作流程有效，评估实验灵敏度，排除假阴性。
设计原理：选用已证实表达靶蛋白的同源或异源组织切片，与待检样本同步染色。若阳性对照中的靶蛋白没有被染色，则需要排查抗体失效、抗原修复不当等问题。若显色正常，则说明ihc操作体系可靠。

靶蛋白定位信息获取途径：
✔ 既往验证数据，如wb、过表达组织等；
✔ 专业数据库，如北欧免疫组织化学质量控制机构（nordiqc）推荐的组织样本；
✔ 抗体说明书，通常会注明该抗体的阳性/阴性对照结果。

2.2阴性对照
目的：检测实验结果是否存在非特异性信号和假阳性，证明观察到的显色反应是靶蛋白的抗原表位与抗体特异性结合所致。
设计原理：选用不表达靶蛋白的组织，与待检样本进行同步处理和免疫标记染色。对比实验结果，如果不显色则结果可靠，如果发生染色则存在非特异性结合。
理想样本：靶基因敲低（kd）或敲除（ko）的组织。如果无法获取ko/kd组织样本，可参考蛋白质图谱数据库（如the human protein atlas），选择靶蛋白天然低表达或不表达的组织。

常见误区警示
令人遗憾的是，有些文章中将省略一抗的对照错误地称为"阴性对照"，并且这种错误做法甚至获得了部分期刊审稿人和编辑的认可。这是一个严重的认知误区。实际上，省略一抗的对照属于"空白对照"，而非真正的阴性对照。
重要文献参考
美国国家癌症研究所hewitt等人在“controls for immunohistochemistry: the histochemical society’s standards of practice for validation of immunohistochemical assays”中，列出了同行评审文章中ihc实验对照必须包含的要素，以确保抗体特异性和结果可靠性。具体内容如下：
1，提供蛋白质印迹法（western blot）的实验记录或参考文献，证明抗体能在细胞裂解液中结合并检测出分子量正确的目标生物分子。
2，清晰说明实验中使用的阳性对照的具体类型。
3，清晰说明实验中使用的阴性对照的具体类型：
a. 阴性对照应使用免疫前血清或同型特异性血清进行。
b. 仅省略一抗的阴性对照本身并不充分，无法有效排除非特异性染色。
4，采用基因工程改造的对照样本（如基因敲除/过表达）以及sirna干预样本，并配合pcr验证，可作为阳性和阴性对照使用。
5,包括“吸附对照（absorption controls）”在内的替代对照方法，不足以充分证明抗体特异性，不推荐作为核心对照依据。

同行评审论文中应包含的ihc实验对照核心要素
（源自文献：hewitt et al. doi: 10.1369/0022155414545224）

2.3空白对照
目的：验证二抗是否存在非特异性结合，但需注意，这并不能证明一抗染色具有特异性。
操作方案：根据实验设计不同，可以细分为无一抗对照和替代对照。
✔ 无一抗对照：在实验中不加入一抗，可加入pbs或tbs缓冲液，或用一抗稀释液孵育样本。除此之外，其他步骤不变，主要用于ihc间接法检测系统。
✔ 替代对照：用一抗同源的动物正常血清或与靶蛋白无关的抗体取代一抗。其他步骤正常操作。对照结果为阴性，说明实验操作合理。
若结果出现阳性信号，提示二抗可能与组织内源性免疫球蛋白结合，需更换二抗。

2.4同型对照
目的：确证靶蛋白与一抗的结合为特异性结合。
操作要点：使用与一抗相同亚型（如igg1、igg2a、igg2b、igm）、相同克隆性、相同宿主种属和相同浓度的、已知不与靶蛋白结合的一抗，在相同的实验条件下与样本进行孵育。
判定标准：若结果为阴性，则证明靶蛋白与一抗为特异性结合。此对照在使用单克隆抗体时尤为重要。

2.5内源性对照
一些组织会产生一定程度的背景染色或自发荧光，例如胶原蛋白和弹性蛋白。嗜酸性粒细胞、脂褐素及某些胚胎组织（如卵黄）也会造成类似的干扰现象。
应对策略：
➢ 预检测：一抗孵育前，利用荧光（适用于荧光标记）或明视场（适用于显色标记）在显微镜下检查细胞和组织，确认无内源性信号干扰。
➢ 优化固定：使用丙酮：甲醇（1:1）混合固定液，可降低部分内源性干扰。
➢ 淬灭信号：苏丹黑等染料，可淬灭特定波长的荧光。
➢ 光谱校正：进行多色荧光检测时，可通过光谱校正区分靶信号与背景

2.6吸附对照
原理：利用过量抗原肽或纯化的免疫原蛋白与一抗预孵育，竞争性封闭抗体结合位点。常用于验证甲基化、乙酰化、磷酸化等修饰位点特异性抗体。也称之为阻断肽对照。
操作流程：将一抗与阻断肽按比例混合孵育后，混合液取代一抗进行ihc实验。

结果解读：如果靶信号显著减弱或消失，表明一抗特异性良好。如果染色变化不大，则说明抗体存在交叉反应或非特异性吸附。
【总结】ihc对照设置速查表

结语：对照设置——ihc实验成功的基石
每一次高质量的ihc检测，都应设置阳性、阴性和空白对照。这是实验成功的底线，也是数据可信的基石。对照不是“锦上添花”的可选项，而是对科学严谨精神的坚守。
染色结果快速准确分析：

请记住：漂亮的染色结果可能会骗人，但经过严格对照验证的ihc结果，能经受住同行评审的检验，能在实验重复中稳定再现，能提高文章发表成功率和影响因子。

参考文献：
1. buchwalow et al. non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. sci. rep. 2011. doi:10.1038/srep00028

2. janardhan et al. immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. toxicol pathol. 2018. doi:10.1177/0192623318776907

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