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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】IPTG诱导大肠杆菌表达的用量，温度，转速等条件是怎样的？
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naonao_1357

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助】IPTG诱导大肠杆菌表达的用量，温度，转速等条件是怎样的？

本人是新手，刚开始实验没多久，最近要做IPTG诱导大肠杆菌表达的实验，载体是PET28a，宿主是BL21。不知道要如何配置IPTG试剂？诱导时用量是多少？培养温度、转速多少合适？有什么需要注意的地方？请高手指教，多谢！
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1楼 2009-11-09 20:57:24
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★
naonao_1357(金币+1,VIP+0):谢谢 11-10 12:12
建议你先分析一下你的蛋白质的性质，比如是否含有大肠杆菌的稀有密码子，大小，疏水性（膜蛋白），是否对细胞具有毒性
如果这些都没有问题的话，那么就容易了，基本大肠杆菌的生长条件；新鲜菌株接种后在OD600=0.3左右加入IPTG到终浓度为1mM,37°，180-200rpm三小时后收集即可
建议在加IPTG前和蛋白收集前取1mL菌液，离心收集细胞，裂解后走SDS-PAGE看看是否有你的蛋白被诱导出来.(严格的说你需要同时诱导空载体的菌株)

如果你不放心，可以在培养基中加点儿葡萄糖防止渗漏表达！
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致良知
2楼2009-11-09 21:03:34
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anmt

银虫 (小有名气)
★
naonao_1357(金币+1,VIP+0):谢谢 11-10 12:12
IPTG一般配制成100mM的储存液，我们做表达用BL21做宿主菌，加三个IPTG的浓度，分别是0.1mM,0.5mM,1mM，然后看哪个浓度最合适就采用哪个浓度。37度，200rpm 4h或者30度过夜诱导，具体看你的蛋白的合成速度及你想要的表达方式。
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3楼2009-11-09 21:23:06
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彩云朵朵

铜虫 (小有名气)

蛋白的合成速度怎么看呢？

引用回帖:
Originally posted by anmt at 2009-11-09 21:23:06:
IPTG一般配制成100mM的储存液，我们做表达用BL21做宿主菌，加三个IPTG的浓度，分别是0.1mM,0.5mM,1mM，然后看哪个浓度最合适就采用哪个浓度。37度，200rpm 4h或者30度过夜诱导，具体看你的蛋白的合成速度及你想要 ...

30°诱导是不是得时间长些好呢？我以前是4个小时。但是现在蛋白表达不出来，很郁闷------
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4楼2010-03-25 15:55:24
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