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石蜡切片免疫组化染色，抗原修复的“非玄学”细节清单
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在石蜡切片的免疫组化染色流程中，抗原修复看似简单实则“暗藏玄机”。甲醛固定会导致抗原表位被封闭。而抗原修复就是逆转甲醛固定过程中形成的蛋白质交联，使被遮蔽的抗原表位重新暴露，从而让抗体能够精准识别并结合目标抗原。 「ihc诊断室」第11期，将系统梳理抗原修复的完整技术体系，从前期准备到方法选择，为实验者提供一份详实可靠的操作指南。 一、前置准备：脱蜡与复水 石蜡切片在烤片机上56℃烘烤2-3小时，可以进一步挥发组织中的水分，使蜡处于半熔状态，有利于脱蜡及防止脱片。 在进行抗原修复前，切片还需要二甲苯脱蜡和乙醇梯度复水。二甲苯既可以溶解石蜡，又与乙醇互溶。用纯二甲苯处理切片，每次10-15分钟，连续浸泡2次，可将石蜡彻底清除。 紧接着将切片依次放入100%、95%、70%、50%乙醇溶液及纯水中，各梯度浸泡2-5分钟，使切片回归水相环境。根据实验条件及样本特性，乙醇处理的时间和梯度设置会有稍微差异。如义翘神州经过十多年的实验积累，构建成熟的快速复水过程，分别用100%、95%、80%、70%的乙醇浸泡2分钟，再用纯水浸泡2次，每次2分钟。 过氧化物酶的灭活在操作上会有差异，有的实验室将其放在抗原修复之前，有的放在之后。常见操作为用3%过氧化氢（用pbs稀释）孵育10分钟，再用pbs浸泡5-8次，每次1分钟，可消除内源性过氧化物酶的活性。 二、抗原修复两大路径：酶解和热诱导 抗原修复可以分为两大类：蛋白酶诱导的表位修复（pier）和热诱导的表位修复（hier）。二者的作用机制和原理存在差异。  2.1 酶修复法：精准切割 水解酶、核酸酶、透明质酸酶等酶可以切割遮蔽抗原表位的肽段，进而恢复抗原的结合活性。pier技术常用的是胰蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶k等水解酶。核酸酶用于er特定抗体的检测，透明质酸酶主要用于纤连蛋白及胶原蛋白等细胞外基质蛋白的检测。 切片固定时间和固定剂种类会影响蛋白的交联程度，且特定酶可能会破坏抗原表位，因此需要针对每种样本和抗原确定适宜的酶处理条件。酶的活性对温度敏感，通常需在37℃条件下进行。胰蛋白酶消化时间约为5至30分钟，胃蛋白酶则需30分钟左右。 然而，蛋白酶对组织形态的潜在破坏，以及对抗原表位的直接损伤风险，使得pier逐渐被热修复技术所替代。但在免疫球蛋白、补体检测及甲醛固定的肾活检标本中，酶消化法仍保持着不可替代的地位。 tips：酶修复操作步骤 1）石蜡切片脱蜡、水化，并浸泡于纯水中。 2）取出切片，吸取组织外的水分，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈，pbs冲洗3×3分钟。 3）切片上滴加适量已稀释成工作液的酶溶液。 4）将切片放入已提前预热至37℃的孵育盒中孵育15-30分钟，pbs冲洗3×3分钟，之后按照相关步骤操作。  2.2 热修复法：温和高效 1991年，石善溶教授开创性地发现高温能够逆转甲醛对蛋白质的交联，开发出热诱导表位修复技术（hier）。hier在特定缓冲液中通过高温处理（通常95℃以上），将变性的蛋白质二级、三级结构恢复折叠，断裂亚甲基桥，暴露抗原表位。与酶修复法相比，hier对组织形态的损伤较为温和，且成功率更高，已成为当今免疫组化实验室的标配技术。 hier的加热工具多样，从家用微波炉到高压锅，从恒温水浴到电蒸锅，各有技术特色。 高压修复：在密闭环境下通过加压使液体温度升至120℃左右，高温高压协同作用有利于抗原修复。与微波和水浴修复相比，组织切片多呈均匀一致的强阳性，定位准确、颜色鲜艳、背景清晰。但易于脱片、使切片不够完整、或有大小不等的缺损。 微波修复：利用微波使分子高速振动产热，操作简单。但存在加热不均的隐患，在同时修复的切片中以及在同一切片的不同部位都可能出现修复不均的现象。其阳性率高于水浴法，低于高压法。 水浴修复：温度恒定、作用温和、重复性好，不易脱片。但修复强度较弱，染色效果较差，且染色深浅不一，容易产生假阴性。 tips 1：微波修复法操作步骤 1）修复液预热：将盛有0.01m柠檬酸盐缓冲液（ph 6.0）的切片盒置入微波炉中，调至高档加热至沸腾。 2）将处理好的切片放入热的修复液中，将微波炉调至中档并持续加热15-20分钟。 3）将切片盒从微波炉取出放置室温冷却。 tips 2：edta高压修复法操作步骤 1）在不锈钢高压锅中加入适量的edta缓冲液（ph 9.0）（如1500ml）。 2）放入切片，盖上高压锅盖子锁定并加盖气阀，加热，待到气阀升起后计时3-5分钟。 3）停止加热，将高压锅置于水槽，自来水冲洗冷却。待温度降至室温后取出玻片架，进行后续抗体孵育、染色等操作。 李新功等人通过40例乳腺癌标本系统比较了3种热诱导抗原修复方法差别。如图所示，高压修复结果显示肿瘤细胞弥漫、均匀一致，微波法修复后染色深浅不一、较弱，水浴法修复后染色同样深浅不一、阳性率较低。  源自文献：三种免疫组化抗原热修复方法的对比分析 三种热修复方式的强度排序为：高压法>微波法≈水浴法>酶修复法。抗原修复运用是否恰当，影响着最终的染色结果和准确性。一般情况推荐高压修复法，可最大限度排除假阴性。抗原修复方法选择需要考虑蛋白亚定位： · 细胞质蛋白：可使用强度适中的微波修复法，能够使抗原表位充分暴露，提高免疫组化检测的灵敏度。胞质蛋白不进行修复处理一般也能获得比较稳定的染色结果。 · 细胞膜蛋白：容易与固定液中的甲醛发生交联反应，形成醛基或羧甲基，造成蛋白构象变化，因此推荐高压修复。微波修复需要延长时间或调高温度。 · 细胞核蛋白：位于细胞核内，难以修复，需要高压120℃修复才能达到理想效果，其他热修复方法不能实现。 三、影响hier效果的关键因素 hier效果受到多种因素的影响，比如修复的温度和时间、修复液的组分与ph值、加热工具及冷却方式等。 1、加热温度与时间：加热设备的功率、修复液的组分和ph、切片体积及组织固定的程度是决定hier持续时间的主要因素。一般，微波修复选择中档15-20分钟，高压修复为120℃ 3-5分钟，水浴选择95-99℃ 20-30分钟。 2、修复液组分及ph值：柠檬酸钠缓冲液（ph 6.0）是常用的修复液，工作浓度在0.01-0.1m之间。在其中加入去污剂（如0.1% tween-20）能提高染色效果，但也会带来明显的组织退化和起泡。其他修复液还有0.1m edta（ph 8.0）、0.1m tris和0.01m edta混合液（ph9.0）等。含edta的修复液抗原恢复效果好，但组织损伤比柠檬酸盐缓冲液明显。 3、修复工具：微波炉、高压锅、电蒸锅、高压灭菌器、水浴锅等都被用于hier。选择工具的首要条件是具备时间和温度控制，重复性好。实验室专用微波炉能够控制时间、功率等，但价格昂贵，且容易沸腾溢液，需要重点关注修复液的体积。推荐小型不锈钢高压锅，可避免修复液挥发，重复性好。 4、冷却方式：推荐平缓冷却，避免抗原暴露不充分。降温太快，组织和载玻片的收缩系数不同，容易造成脱片。 四、是否所有的蛋白都必须抗原修复？ 抗原修复主要用于石蜡切片，冰冻切片一般不用。多克隆抗体因能识别多个表位，即便不进行修复，检出率也常优于单克隆抗体。对于福尔马林固定石蜡包埋（ffpe）组织，抗原修复仍是强烈推荐的标准流程。 抗原修复是双刃剑，必须正确使用，否则会导致假阳性、假阴性或结果误判。如图所示，以b细胞特异性标志物pax5抗体对大鼠脾脏进行的ihc为例，不做抗原修复（a）信号微弱，大部分组织呈阴性，而经过抗原修复（b）后染色信号明显增强，b细胞呈现棕黄色阳性。 抗原修复方法不当会导致结果误判。在检测小鼠肺组织细胞凋亡蛋白tunel时，采用高压、柠檬酸盐修复（c），几乎所有细胞核（包括气道上皮和肺泡细胞）都被染成深褐色。而蛋白酶k修复（d），仅在气道上皮细胞处观察到特异性结果，背景干净。选择不合适的抗原修复方法，会造成非特异性结合，出现错误的结果判读。 有些蛋白在进行抗原修复后会诱发非特异性染色，如小鼠子宫的平滑肌肌动蛋白（sma）。如图e，不进行抗原修复时sma在子宫肌层（星号）和血管（箭头）特异性染色，上皮组织和间质细胞为阴性，符合sma的正常亚细胞定位。但过度修复后，上皮组织和间质细胞也会出现阳性结果。  抗原修复对ihc结果的影响 （源自文章：immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology） 有些蛋白可能不适用酶修复或热诱导修复，需要使用特殊的蛋白质变性剂暴露抗原表位。如sds处理会增强atp酶、小窝蛋白、微管蛋白等抗原的细胞和冰冻切片的染色结果。6m 盐酸胍能增强淀粉样原纤维、高尔基中朊蛋白的免疫染色。于70%乙醇的koh处理石蜡切片，可以暴露婴儿指部纤维瘤细胞内肌动蛋白的抗原表位。甲酸和热处理联合应用已广泛用于免疫组化分析中枢及系统性淀粉样蛋白的沉淀检测。 总结建议 理想的抗原修复效果应达到： ✔ 组织结构、细胞形态保存完好； ✔ 阳性信号强，亚细胞定位准确； ✔ 没有非特异性染色； ✔ 提高抗体稀释度，降低实验成本。 这一目标的实现，离不开对技术细节的极致追求。修复液量必须充足，确保组织始终浸没。加热过程严防液体蒸发导致干片。修复后充分流水冲洗，去除残留缓冲液对后续染色的干扰。 抗原修复首选高压法，效果不佳时尝试用edta（ph8.0）或tris-edta（ph9.0）修复液。应根据抗体类型、抗原特性及组织情况评估抗原修复的必要性，避免出现非特异性的假阳性结果。 参考文献： 1. buchwalow et al. non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. sci. rep. 2011. doi:10.1038/srep00028 2. janardhan et al. immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. toxicol pathol. 2018. doi:10.1177/0192623318776907 |
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