可以的，以前实验室有人用过。

远了较好，其实20个碱基也够了
酶切效率都不错，看看只要缓冲液通用就行了 我觉得就看哪两个的缓冲液匹配率高了，别没什么问题 pET-28也是很成熟的载体
祝顺利，

高手帮忙啊

都可以，不过感觉前面的相隔比较近，可能对酶切效率有一定的影响。NcoI和HindIII可以，只要不要让NcoI影响ORF就行了。

记忆中这三个酶的酶切效率都挺高的，连接效率就要看你用什么连接酶了，可以买高效连接液，反应时间短效率也高。

好像Nco 1的GC含量很高，设计引物不好平衡。