求助大神们，PCR引物C端如何加蛋白标签flag？
急急急，求大神们救救急（。。。。。。。。。。。。。。。。凑字数。。。。。。。。。。。。。。。。。前面的帖子以及删了，怎么这个还提示
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老师让我在引物（PCR引物）序列中引入蛋白标签flag，方便后续的纯化。我的蛋白是分泌蛋白，我查到分泌蛋白一般建议把标签插在C端，求问大神们，我这样设计对不对？
上游引物F ：CCC（保护碱基）+ AAGCTT （酶切位点）+ KOZAK序列 +引物序列+GATTACAAGGATGACGACGATAAG（标签序列）
下游引物R：GC（保护碱基）+ GTCGAC（酶切位点） +引物序列 +CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC（flag标签序列反向互补）
我之前查的有人说说标签蛋白只需要加在上游引物就行，下游不用加？但那样两个的TM值不就差距很大了吗？
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大神，你的意思是下游引物的蛋白标签应该在引物序列之前吗？是这样吗？
上游引物F ：CG（保护碱基）+ AAGCTT （酶切位点）+ KOZAK序列 +引物序列
下游引物R：CG（保护碱基）+ GTCGAC（酶切位点） +蛋白标签序列 +引物序列
引物设计我也用的Prime5软件，师姐跟我说设计完把保护碱基酶切位点加上去就行。迷惑的点就是蛋白标签位置应该加在哪里？师姐她之前也没有这个经验。大神，那你这层楼的意思我没大懂。你看可以顺序可以这么来吗？
上游引物F ：CG（保护碱基）+ AAGCTT （酶切位点）+ KOZAK序列 +引物序列
下游引物R：CG（保护碱基）+ GTCGAC（酶切位点） +蛋白标签序列 +引物序列
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