表达的蛋白质用tev酶切割后,目标蛋白无法与原蛋白分离
我的蛋白在表达后需要用tev酶切除His标签,可是切完后总是切不完,而且切下来的目标蛋白好像会和原蛋白有相互作用,无法再用Ni-NTA分离(切下来的目标蛋白已经没有了his标签,却无法从镍柱上洗脱下来,之后用凝胶层析也无法将原蛋白和切下来的蛋白分离,SDSPAGE显示两种蛋白在同一个峰里)。
现在我考虑的是两种方法:
1. 提高tev酶的活性,将原蛋白尽量全部酶切,只剩下目标蛋白和切下来的his标签,这样就能分离出目标蛋白。但尝试很多条件都无法达到,总是剩下大概一半的蛋白切不动。
2. 添加一些试剂破坏原蛋白和目标蛋白的相互作用。我的蛋白里有很多二硫键,所以试过GSH和GSSG,但没有用。
大家有没有什么好方法呢?
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确定是有相互作用?切完后你的目的蛋白应该在穿透液中或者在低浓度(小于50mM)咪唑洗脱中。
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要么你用柱上酶切。也可以。有相互作用就加点吐温(疏水相互作用),或者加点还原剂
巯基乙醇,DTT